扇贝多肽对UVA损伤HaCaT细胞UCP2表达及线粒体功能的影响

王春波，孙 霞，李金莲，韩彦弢，陈雪红，谢 靖

(1.青岛大学医学院，山东青岛 266071;2.滨州医学院，山东 烟台 264003)

线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)是线粒体内膜质子转运蛋白家族的成员之一，在哺乳动物多种组织中广泛表达，通过使氧化磷酸化解偶联，降低线粒体内膜电势，减少细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，参与多种组织的抗氧化应激损伤［1－2］。研究已证实［3］，UVA主要是通过诱导角质形成细胞内ROS过度积累而引发凋亡的，高浓度的ROS极易氧化损伤线粒体内膜、DNA等超微结构，导致线粒体功能丧失，最终引起细胞氧化损伤。紫外线照射对UCP2是否会有影响，UCP2在UVA诱导的HaCaT细胞损伤中有何作用?目前国内外尚未见报道。本实验旨在观察UVA照射后HaCaT细胞UCP2表达的变化，并应用海洋抗氧化剂扇贝多肽(polypeptide from Chlamys farreri，PCF)，观察其对 UVA照射后 ROS释放、UCP2表达及线粒体凋亡途径、线粒体呼吸链复合酶活性的影响，探究扇贝多肽对UVA损伤HaCaT细胞线粒体功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和器材 PCF由中国水产科学研究院黄海水产研究所分离纯化;DMEM培养基、胰蛋白酶购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;UCP2多克隆抗体购自Millipore公司;Apaf-1、Cyt C多克隆抗体购自Cell Signaling公司;β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;线粒体提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;线粒体呼吸链复合物I活性定量检测试剂盒购自Genmed公司。紫外辐照仪由北京师范大学光电仪器厂制造。

1.2 细胞培养 永生化人角质形成细胞株HaCaT由韩国延世大学医学院病理教研室惠赠。HaCaT细胞用DMEM培养液(含体积分数为0.10的胎牛血清、1 ×105U·L－1青霉素钠、1 ×105U·L－1硫酸链霉素)，置于37℃、含体积分数为5%CO2的细胞培养箱中常规培养。

1.3 实验分组及UVA照射 将处于指数生长期的细胞随机分组:① 对照组:正常培养的细胞;②模型组:UVA辐射损伤的细胞;③PCF组:预先在细胞培养液中加入不同浓度的PCF预孵育2 h后再经UVA照射。PCF设有 5.69、2.84和 1.42 mmol·L－13个浓度。

UVA照射剂量为8 J·cm－2。将细胞接种于6孔板进行培养，待细胞进入指数生长期，融合达0.80以上时，用铝箔盖住对照组细胞进行UVA照射。照射时弃去旧培养液，用D-Hanks冲洗2次，每孔入2 ml D-Hanks液覆盖细胞。照射结束后，换新鲜培养液根据实验需求置于培养箱培养适宜时间。

1.4 电子自旋共振 (electron spin resonance，ESR)检测ROS释放量 每组取1×108细胞，用含10 mmol·L－1PBN、2 mmol·L－1DETAPAC 的磷酸HEPES缓冲液冰浴匀浆，离心后取上清1.4 ml，分别加入0.5 mol·L－1Na2S2O4，0.6 mol·L－1DETC，10 mmol·L－1L-Arg，0.3 mol·L－1FeSO4各 30 μl，37℃水浴30 min;迅速放于冰上，加入0.3 ml乙酸乙酯，振荡后离心8 min，取上清测定。检测条件:中心磁场3385 G，微波功率20 mW，扫宽400 G，放大倍数4×105。

1.5 Western blot 细胞按实验分组经UVA照射处理后，弃去旧培养液用预冷的D-Hanks冲洗3次后将培养板置于冰上，每孔约1×106个细胞加100 μl裂解液冰上裂解30 min，裂解充分后，将细胞刮下置于1.5 ml离心管中，4℃、12 000×g离心 5 min，收集上清，即为细胞总蛋白质。线粒体及胞质蛋白的提取按说明书操作，用于Cyt C释放及线粒体UCP2表达、呼吸链复合酶Ⅰ活性的检测。

BCA法测定蛋白浓度，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，然后将NC膜置于封闭液中室温封闭1～2 h，一抗(β-actin 1 ∶400，Apaf-1、Cyt C、UCP2 均为 1∶1 000)4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次5 min;按照1∶1 000的比例加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃孵育40 min;TBST洗涤3次，每次5 min。DAB显色，凝胶分析软件Quantity one进行灰度分析。

1.6 流式细胞仪测定线粒体膜电位 按实验设计分组并处理细胞后，收集各组细胞，加入终浓度10 mg·L－1的 Rh123，37℃ 避光孵育 30 min，PBS 洗涤2次以去除未结合的染料，加 PBS 300 μl，混匀，流式细胞仪测定其平均荧光强度。

1.7 紫外分光光度法检测呼吸链复合酶Ⅰ的活性

取线粒体蛋白 5～10 μg，于 －20℃/20℃ 反复冻融3次以达到最大反应速度，按照试剂盒说明书测定340 nm处NADH的吸收值表示呼吸链复合酶Ⅰ的活性。

2 结果

2.1 UVA照射HaCaT细胞后UCP2蛋白表达的变化 UVA 照射后不同时间点(1、3、6、8、12、24 h)收集细胞，Western blot检测UVA照射后HaCaT细胞线粒体中UCP2蛋白表达的经时变化。结果如Fig 1所示，正常组细胞线粒体UCP2表达很少，UVA照射后1 h未见明显变化，照射后3 h表达增加并达到高峰，随后又逐渐下降，24 h时表达水平与1 h基本一致。

Fig 1 Changes of UCP2 protein expression after UVA radiation in mitochondria of HaCaT cells

Fig 2 Effect of PCF on ROS release in HaCaT cells after UVA radiation(±s，n=3)

2.2 PCF对UVA照射后HaCaT细胞ROS释放的影响 分别于UVA照射后1、3、12、18 h收集细胞。PCF组于照射前 2 h加入 2.84 mmol·L－1PCF。ESR检测ROS的释放，ROS释放量以3个释放波峰值的平均值表示。结果如Fig 2所示，UVA照射后1 h ROS即迅速升高，随后有所降低。PCF对各检测时间点ROS的释放均有抑制作用，12 h和18 h作用最强。

2.3 PCF对UVA照射后HaCaT细胞UCP2蛋白表达的影响 根据上述实验结果，在UVA照射后3 h UCP2表达为高峰，因此实验选用3 h作为观察PCF作用的时间点。UCP2表达水平以UCP2与βactin光密度比值表示，结果如Fig 3所示，UVA照射后3h线粒体UCP2表达量明显增加，与正常组相比差异有显著性(P＜0.01);PCF预孵育能降低UCP2的表达，与模型组相比差异有显著性(P＜0.01)，且有随剂量增加作用增强的趋势。ROS抑制剂NAC预孵育亦明显降低了UCP2的表达。

Fig 3 Effect of PCF on UVA-induced UCP2 protein

2.4 PCF对UVA照射后HaCaT细胞线粒体膜电位的影响 流式细胞仪分析结果显示(Fig 4)，UVA照射后，HaCaT细胞内Rh123荧光强度明显下降(P＜0.01)，表明线粒体跨膜电位下降，提示UVA照射对HaCaT细胞线粒体膜造成了损伤，经过PCF预孵育的细胞线粒体跨膜电位有明显的提高。

2.5 PCF对UVA照射后HaCaT细胞Cyt C蛋白表达的影响 Western blot分别检测HaCaT细胞胞质和线粒体内Cyt C的蛋白表达水平。Fig 5结果显示，UVA照射HaCaT细胞后18 h，与正常对照组相比，模型组HaCaT细胞线粒体内Cyt C表达降低，而胞质内Cyt C表达明显增高(P＜0.01)，说明UVA照射诱导了HaCaT细胞CytC的释放。与模型组相比较，PCF抑制了UVA诱导的HaCaT细胞线粒体内Cyt C的减少和胞质内Cyt C表达的增加，表明PCF可抑制Cyt C从线粒体向胞质的转移。

Fig 4 Effect of PCF on mitochondria membrane

Fig 5 Effect of PCF on UVA-induced Cyt C release in HaCaT cells(±s，n=3)

2.6 PCF对UVA照射后HaCaT细胞Apaf-1蛋白表达的影响 UVA照射后18 h收集细胞，Western blot检测各组细胞Apaf-1蛋白表达水平，以Apaf-1与β-actin光密度比值表示。Western blot结果显示(Fig 6)，UVA模型组与正常对照组相比较，Apaf-1蛋白水平明显增加(P＜0.01)，与UVA模型组相比，除低剂量PCF组(1.42 mmol·L－1)外，中、高剂量PCF均能明显抑制Apaf-1的表达(P＜0.01)。

Fig 6 Effect of PCF on UVA-induced Apaf-1 expression in HaCaT cells(±s，n=3)

2.7 PCF对UVA照射后HaCaT细胞呼吸链复合酶Ⅰ活性的影响 紫外分光光度法检测呼吸链复合酶I的活性，结果显示，UVA模型组呼吸链复合酶I的活性明显下降(P＜0.01)，预先加入PCF孵育的各组细胞呼吸链复合酶I活性的下降被抑制，与模型组比较差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01)。见Tab 1。

Tab 1 Effect of PCF on the activity of complexⅠof respiratory chain in HaCaT cells after UVA radiation(±s，n=9)

Tab 1 Effect of PCF on the activity of complexⅠof respiratory chain in HaCaT cells after UVA radiation(±s，n=9)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs UVA model;△P＜0.05 vs 1.42 mmol·L－1PCF

Group Complex Ⅰ activity/μmol·min－1·g －1 Normal 63.5 ±4.1 UVA Model 44.9 ±4.8##PCF 1.42 mmol·L－1 53.2 ±3.5*PCF 2.84 mmol·L－1 60.1 ±1.6＊＊△PCF 5.68 mmol·L－1 62.8 ±3.6＊＊△

3 讨论

线粒体主要功能之一是通过氧化磷酸化作用，把各种能量转换成ATP。线粒体解偶联蛋白2(UCP2)是位于线粒体内膜上的质子转运体，具有使线粒体呼吸链与ADP的磷酸化解偶联的作用［1］。研究表明，UCP2参与了ROS的调控:外源产生的过氧化物能够在细胞体系中激活UCP2依赖的质子漏［4］，导致线粒体内膜电势下降，降低了ROS的水平，限制了线粒体内过氧化物的产生，以保护机体免受过氧化损伤。

既然ROS在UVA照射后会大量产生，UVA照射是否会影响UCP2的表达还未见报道。本实验通过Western blot检测UVA照射HaCaT细胞后不同时间点线粒体中UCP2蛋白表达的变化，结果发现，正常HaCaT细胞表达UCP2很少，UVA照射后细胞线粒体UCP2表达升高，3 h即达最高值，随后逐渐下降。采用ROS抑制剂NAC预孵育HaCaT后再经UVA照射，UCP2表达明显降低。参考文献报道并分析认为［1－2，4］，UVA 照射后产生的 ROS 或过氧化物是刺激UCP2表达的因素之一，UCP2表达的增高增强了线粒体呼吸链与ADP磷酸化的解偶联作用，从而降低线粒体内膜质子电化学梯度，ROS产生减少。HaCaT细胞通过增加UCP2的表达来抑制UVA诱导的ROS的产生，是一种自身负反馈调节机制。

扇贝多肽是自海洋贝类废弃物中提取的海洋抗氧化多肽，可抑制 UVA诱导的 HaCaT细胞凋亡［5－6］。实验中采用ESR技术直接检测ROS的释放情况，证实了PCF对 UVA引起的ROS的产生和释放有明显的抑制作用。Western blot检测PCF对UCP2表达的影响，发现应用不同剂量 PCF后，UCP2的蛋白表达量与UVA模型组相比都有明显降低，可能是由于PCF抑制了UVA照射后ROS的产生或过氧化物的生成从而减弱了ROS对UCP2表达的刺激作用。

UCP2的解偶联作用对细胞的影响是两方面的［7］:一方面降低了ROS的产生，起保护细胞的作用，如文献报道［8］，UCP2高表达能够抑制细胞因ROS产生增多而引起的凋亡;另一方面也使得细胞内ATP合成减少，使细胞无法获得足够的ATP以抵御伤害性刺激。哪一方面起主要作用会根据细胞的种类和所受刺激的不同而不同，在某些情况下后者对细胞的影响可能更为明显［9］。前期实验证实应用PCF后UVA诱导的细胞凋亡是降低的，说明PCF并未因其减弱UCP2的表达而增加细胞凋亡，也说明UVA照射后UCP2的高表达对细胞的影响可能第二方面是主要的，这还需要进一步的实验证实。

线粒体是细胞内ROS来源的一个主要途径，也是ROS攻击的主要目标。本实验以流式细胞术检测HaCaT细胞线粒体膜电位，发现 UVA损伤HaCaT细胞引起线粒体膜电位明显下降，而PCF则剂量依赖性升高线粒体膜电位。同时，PCF对UVA照射引起的细胞色素C的释放及Apaf-1的蛋白表达也起到了有效的抑制作用。课题组前期实验结果已经证实了PCF对UVA诱导的caspase-3活化的抑制作用［10］，综合本次实验结果可以表明，PCF能够抑制UVA照射后ROS的产生，从而保护线粒体膜，抑制线粒体Cyt C/Apaf-1/caspase-3凋亡通路。

线粒体内发生的主要代谢是氧化磷酸化，它是位于线粒体内膜上的呼吸链功能的主要表现，也是细胞内ROS来源的一个主要途径。呼吸链中复合酶Ⅰ(NADH-辅酶Q还原酶)和复合酶Ⅲ(辅酶Q-细胞色素C还原酶)是产生超氧阴离子的主要部位，复合酶Ⅰ是呼吸链中最大的、也是第一个复合体，早有研究证实线粒体呼吸链复合酶I的抑制剂可诱导细胞凋亡［11－12］。本实验通过紫外分光光度法检测线粒体呼吸链复合酶I的活性，进一步探讨UVA辐射对HaCaT细胞线粒体功能的影响及PCF是否具有调节作用。结果显示，UVA模型组呼吸链复合酶I的活性明显下降，而预先加入PCF孵育的细胞呼吸链复合酶I活性的下降被抑制，说明PCF也可以通过提高呼吸链复合酶I的活性，减少ROS的生成，从而抑制UVA引起的细胞损伤。

综合上述实验结果可以推测，PCF可以增强UVA照射后线粒体呼吸链复合酶的活性，抑制ROS的产生，减弱ROS对线粒体的损伤，抑制线粒体CytC/Apaf-1/caspase-3凋亡通路，最终达到抑制细胞凋亡的作用。虽然PCF也可抑制UVA照射引起的UCP2表达增加，减弱细胞的自身负反馈调节，但对细胞活性没有产生明显的影响。

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