重组人5型腺病毒在体外对A549细胞的影响

蒋 力，侯 兵，崔珂钒，闵家新

(中国人民解放军第三军医大学新桥医院胸外科，重庆 400037)

肿瘤的发生是多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。在本研究中，笔者综合评价了重组人5型腺病毒在体外的抗肿瘤效应，揭示了其对肿瘤细胞生物学效应的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Model 2300 CO2型细胞孵育箱(美国Shellab公司);移液器(德国Eppedorf公司)。A549细胞(由第三军医大学西南医院脑外科夏永智博士惠赠);重组人5型腺病毒(商品名安柯瑞®，上海三维生物技术有限公司，批号为20110401);RPMI 1640培养基、小牛血清均购自GibcoPBRL公司;Transwell小室、MTT试剂盒均购自美国Sigma公司;TUNEL试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 A549 细胞培养及传代

将复苏后的A549细胞置含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于5%CO2和37℃、饱和湿度的孵育箱中培养，细胞贴壁形态正常，生长良好，隔天换液并传代1次;细胞处于对数生长期、成活率大于95%时，以0.25%胰酶消化培养瓶内单层细胞，将细胞悬液移入离心管内，常温下800～1000 r/min低速离心5 min，吸去上清液，加入无血清RPMI 1640培养基，重悬细胞，计数板计数细胞。在96孔板中分3组，每组设5个复孔，每孔取3×105个/L细胞，放入孵育箱中培养24 h后用于转染。

1.2.2 细胞增殖曲线测定

采用3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测加入重组人5型腺病毒(质量浓度分别为5，10，15，20μg/mL)培养时 A549 细胞(试验组)12，24，48，72 h 时内皮细胞的存活率。以正常生长的A549细胞为对照组。用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，接种到96孔板，每孔1000～10000个细胞，每孔体积200 μL，培养3～5 d后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分融解，选择490 nm波长在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值，试验结果用细胞存活率表示。细胞存活率(%)=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100% 。

1.2.3 细胞迁徙试验

将小室放入24孔培养板中，在上室加入300 μL预温的无血清培养基，室温下静置15～30 min，使基质胶水化，吸去剩余培养液，制备无血清细胞悬液(2～3×105个/mL);24孔板下室加入500 μL含20%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基，取细胞悬液200 μL加入Transwell小室，注意防止下层培养液和小室间产生气泡，常规培养12～24 h;取出小室，用棉签擦去基质胶和上室一侧的细胞，用手术刀将膜切下，用90%酒精常温固定30 min，0.1%结晶紫常温染色10 min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，取3～5个视野计数细胞个数。将上室液更换为质量浓度为20μg/mL的重组人5型腺病毒培养液，重复以上试验步骤。

1.2.4 细胞周期检测

将A549细胞分为对照组及试验组，每组12孔，接种到24孔板内。24 h后，A549细胞试验组换为质量浓度为20μg/mL的重组人5型腺病毒无血清培养液，培养3 d后，以0.25%胰酶消化，收集细胞，800 r/min离心5 min，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗，吹打成单细胞悬液，70%冷乙醇4℃下固定24 h，RNAase消化，碘化丙啶标记，在激发光波长488 nm、检测光波长610 nm下用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 细胞凋亡试验

将A549细胞分别按每孔4×104个/mL、每组12孔接种到24孔板，共两组。24 h后，一组12孔更换为质量浓度为0.20μg/mL的重组人5型腺病毒无血清培养液，设为A549细胞试验组，其余为对照组。72 h后将细胞用3.7%中性福尔马林固定10 min，经100%，95%，70%梯度浓度的酒精各水化5 min，磷酸盐缓冲液室温荡洗10 min，每孔滴加 50 μL Cytonin，室温 30 min，DNase－free水洗 2 次，每次2 min，加入新鲜配置的3%H2O2溶液，室温5 min，磷酸盐缓冲液洗1 min，TdT标记缓冲液室温孵育5 min，每孔滴加50 μL标记反应混和液，37℃ 1 h后用TdT终止缓冲液室温作用5 min，倒置荧光显微镜下观察，绿色荧光颗粒者为凋亡细胞。

2 结果

2.1 重组人5型腺病毒对细胞增殖的影响

结果见表1。

表1 不同质量浓度重组人5型腺病毒对A549细胞存活率的影响(%，)

表1 不同质量浓度重组人5型腺病毒对A549细胞存活率的影响(%，)

注:与对照组相比，＊P＜0.01;与同一浓度前一时相比较，△P＜0.01。

2.2 细胞迁徙试验

结果见图1。重组人5型腺病毒能显著抑制A549细胞的迁徙能力。正常A549细胞与加入20μg/mL重组人5型腺病毒培养的A549细胞比较，迁徙试验结果有显著性差异(P＜0.01)。

图1 重组人5型腺病毒对A549细胞迁徙的影响

2.3 重组人5型腺病毒对内皮细胞细胞周期的影响

以含重组人5型腺病毒质量浓度为20μg/mL培养液培养72 h后，经细胞周期测定，试验组G0/G1期A549细胞所占比例为77.41%，S 期细胞 22.41%，G2－M 期细胞占 2.19%;对照组 G0/G1期A549细胞所占比例为76.97%，S期细胞占9.21%，G2－M期细胞占13.62%。结果显示，试验组细胞被阻滞于S期，细胞增殖显著被抑制(P ＜0.01)。结果见图 2。

图2 重组人5型腺病毒对A549细胞周期分布的影响

2.4 重组人5型腺病毒对细胞凋亡的影响

以含重组人5型腺病毒质量浓度为20μg/mL的培养液培育A549细胞72 h后，TUNEL法检测细胞凋亡。结果显示，加入重组人5型腺病毒培养后，A549细胞凋亡数较正常培养A549细胞明显增加(n=20，P ＜0.01)，见图 3。

图3 重组人5型腺病毒对细胞凋亡的影响

3 讨论

肿瘤形成是一个多因素、多基因参与的过程，其中p53基因的失活对肿瘤形成起着重要作用。p53基因与人类50%的肿瘤有关，目前发现的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等[2]。重组人5型腺病毒是利用基因工程技术对人5型腺病毒(Ad5)进行基因重组而得到的一种溶瘤腺病毒，其删除了人5型腺病毒的E1B－55 kD和E3区19 kD基因片段，能在肿瘤细胞中特异性复制而最终溶瘤[3]。

重组人5型腺病毒注射液特异性杀死肿瘤细胞的原理有:直接在肿瘤细胞中复制、包装，最终导致肿瘤细胞裂解;增加受感染肿瘤细胞对由细胞因子等引起的免疫反应的敏感性，加速受感染细胞的死亡;所表达的抗原诱发MHC I在被感染肿瘤细胞表面的表达，引导机体产生针对性的T细胞免疫反应;E1A区可增强肿瘤细胞对化学治疗的敏感性[4]。

本研究证实，重组人5型腺病毒在体外能明显抑制A549细胞的生长并促进其调亡。但是，将重组人5型腺病毒制成临床抗癌药物仍需克服一些难题，如药效的特异性及局部药物浓度过低等。

[1]Kenneth R，Rog Lski，Svend O，et al.In Vivo Antitumor Activity of ONYX－015 Is Influenced by p53 Status and Is Augmented by Radiotherapy[J].Cancer Research，2000，60:1193－1196.

[2]Thomas Rothmann，Arnd Hengstermann，Noel J，et al.ONXY－015，Replication of ONYX－015，a Potential Anticancer Adenovirus，Is Independent of p53 Status in Tumor Cells[J].Journal of Virology，1998，72(12):9470－9478.

[3]Brett R，Dix，Sara J.Braithwaite.Does the antitumor adenovirus ONYX－015/dl1520 selectively target cells defective in the p53 pathway[J].Journal of Virology，2001，75(12):5443－5447.

[4]Cheng－Ta Yang，Liang You，Kazutsugu Uematsu，et al.P14ARF Modulates the cytolytic effect of ONYX－015 in mesothelioma Cells with wild－type p53[J].Cancer Research，2001(61):5959－5963.