旋覆花素体外抗肿瘤作用研究

魏海青 李 军霞 王永利

肿瘤是一类常见病、多发病，已成为危害人类健康最严重的疾病之一。化学治疗是治疗癌症的主要手段，但化疗药物在对肿瘤细胞发挥细胞毒作用的同时，会引起一系列的不良反应，如骨髓抑制、消化道反应等。因而，近年从天然药物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物成为研究热点［1，2］，菊科旋覆花属植物欧亚旋覆花素是一种传统中草药，具有抗炎，抗肝炎、抗肝损伤等作用［3，4］，本实验研究旋覆花素对小鼠肝癌 H22细胞株、小鼠肉瘤S180细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人卵巢癌SK-OV3细胞株及人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用，并将同一浓度对以上5种肿瘤细胞的生长抑制作用进行对比，了解其对以上5种肿瘤细胞的生长抑制作用特点。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株:小鼠肝癌H22细胞、小鼠肉瘤S180、人肺腺癌A549细胞、人卵巢癌SK-OV3细胞、人宫颈癌细胞株Hela细胞。河北医科大学药理教研室传代保存。

1.2 药品与试剂 RPMI-1640培养基和小牛血清购自美国GIBCO公司;青霉素、链霉素购自华北制药厂;顺铂注射液(DDP)购自南京制药厂;二甲基亚砜(DMSO)、MTT、丫啶橙、溴化乙锭购自美国Sigma公司。旋覆花素由河北医科大学药理教研室药学院自制。

1.3 主要仪器 VD-1320型洁净工作台产自哈尔滨市东联电子技术发展有限公司;CO2培养箱产自日本 Sanyo公司;Floustar多功能分析仪产自德国BMG公司;平板离心机产自德国eppendorf公司;XDS-1B型倒置生物显微镜产自重庆光电仪器有限公司;激光共聚焦显微镜产自德国Leica等。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及实验分组:取对数生长期的 H22、S180、A549、SK-OV3、Hela细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml的细胞悬液。将细胞悬液种植于96孔培养板中，每孔100 μl，按分组方法加入相应的药物，置5%CO2、37℃培养箱内培养72 h，每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，继续培养4 h，离心，弃去各孔上清，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min使其溶解后，测定样品吸光度值，并计算半数抑制浓度IC50。实验分为阴性对照组、药物组、阳性对照组(顺铂)。

1.4.2 倒置显微镜下观察旋覆花素对以上5种肿瘤细胞形态的影响:取对数生长期的细胞，培养方法和实验分组同上，给药72 h后观察各组细胞形态学变化。

1.4.3 在激光共聚焦显微镜下观察旋覆花素对以上5种肿瘤细胞形态的影响:取对数生长期的细胞，培养方法和实验分组同上，给药72 h后取出细胞悬液滴于载玻片上，滴加丫啶橙/溴化乙锭染色，置共聚焦显微镜下观察。活细胞核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状;死亡细胞核染色质着橘红色并呈正常结构;晚期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。

1.5 统计学分析 应用 Origin 17.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，量效曲线拟合选用Hill法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对细胞的抑制的作用 对小鼠肝癌H22细胞株、小鼠肉瘤S180细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人卵巢癌SK-OV3细胞株及人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用以及对比顺铂(1 000 μg/ml)对 H22细胞、S180细胞、A549细胞、SK-OV3和Hela细胞的抑制率为(91.9 ±2.9)%、(84.6 ±5.0)%、(79.8±4.5)%、(80.4 ±3.8)%和(8.0 ±2.2)%。旋覆花素对肿瘤细胞的生长抑制作用有一定的选择性，旋覆花素对H22、S180、A549及SK-OV3 4种肿瘤细胞的生长抑制作用均较明显，而对Hela细胞的抑制作用均较低，在1 000 μg/ml剂量时，旋覆花素对H22细胞株、S180细胞株、A549细胞株、K-OV3细胞株及Hela细胞株的抑制率分别为 92.39%，88.90%，89.51%，67.50%，12.36%。与顺铂阳性对照组相比，除Hela细胞外，对其他4种细胞的抑制作用与阳性对照组的抑制率相差不多，显示出明显的抑制作用，而且对这四种细胞的生长抑制作用随剂量的增加而增高。见表1、2，图1。

表1 旋覆花素对H22、S180、A549细胞的抑制作用n=9，%，±s

表1 旋覆花素对H22、S180、A549细胞的抑制作用n=9，%，±s

注:H22细胞的IC50为(76±4)μg/ml;S180细胞 IC50为(244±24)μg/ml;A549细胞IC50为(102±9)μg/ml

浓度(μg/ml) H22抑制率 S180抑制率 A549抑制率31.25 11.5 ±6.0 5.1 ±2.0 13.5 ±1.5 62.5 34.4 ±5.5 8.4 ±3.7 25.9 ±4.9 125 70.1 ±3.3 12.0 ±4.9 56.8 ±3.4 250 80.3 ±5.5 46.4 ±4.1 72.3 ±3.3 500 86.0 ±4.0 84.7 ±2.2 88.0 ±5.3 1 000 92.4 ±3.9 88.9 ±4.8 89.5 ±3.9

表2 旋覆花素对SK-OV3、Hela细胞的抑制作用 n=9，%，±s

表2 旋覆花素对SK-OV3、Hela细胞的抑制作用 n=9，%，±s

注:SK-OV3细胞 的IC50为(171±11)μg/ml;Hela细胞 IC50不确定

浓度(μg/ml) SK-OV3抑制率 Hela抑制率31.25 3.8 ±2.8 1.5 ±1.3 62.5 6.7 ±4.8 3.9 ±1.5 125 18.2 ±4.6 14.1 ±0.7 250 52.3 ±4.0 17.6 ±1.6 500 65.6 ±4.4 13.9 ±0.8 1 000 67.5 ±5.9 12.4 ±1.1

图1 不同浓度旋覆花素对H22、S180、A-549、SK-OV3和Hela细胞的抑制作用

2.2 细胞形态

图2 激光扫描共聚焦显微镜下细胞形态变化

2.2.1 倒置显微镜下观察:阴性对照组H22细胞形态较圆，细胞膜比较完整光滑，旋覆花素组的细胞形态较为不规则，膜表面不平整，出现皱缩，胞浆内容物外泄，随着含药浓度的增加，圆形细胞密度数目不断减少，不规则及碎裂的细胞数目不断增加，细胞生长总体密度明显下降;阴性对照组的S180细胞状态良好，旋覆花素组的细胞均可见形态的变化，出现部分细胞脱落，漂浮于培养液中，也有部分细胞体积增大、肿胀、破裂，呈坏死状;阴性对照组的A549细胞形态良好呈梭形，细胞膜完整，旋覆花素组可见随着浓度的增加，细胞皱缩，形状不规则，数目减少，有些细胞变小、变圆，有些细胞变大、到高浓度时可见较多的死亡细胞，特别是1 000 μg/ml浓度时，作用 A549细胞72 h后，可见更多的死亡细胞;阴性对照组的SK-OV3细胞形态良好，旋覆花素组可见随时间推移出现细胞皱缩，细胞数目随浓度增加明显较少，培养液中可见坏死状细胞明显增多;阴性对照组的Hela细胞生长良好，细胞伸展，呈不规则多角形。旋覆花素组细胞数目无明显减少，随着时间的推移，细胞皱缩不明显，培养液中有少许漂浮的呈桑叶状细胞，随浓度增高时上述改变也不明显。

2.2.2 激光扫描共聚焦显微镜下观察:阴性对照组H22细胞结构清晰，胞浆较丰富，呈均匀的橘黄色或橘红色荧光，胞核呈黄色或黄绿色均匀荧光，旋覆花素组的细胞核致密浓染或呈黄绿色碎片状，也可见到荧光染色减弱或消失的坏死细胞形态;阴性对照组S180细胞荧光染色均匀，未见荧光染色减弱或消失的坏死细胞形态，旋覆花素组可见细胞核固缩、碎裂、染色质边集并出现凋亡细胞;阴性对照组A549细胞荧光染色较浅且较均匀，未见凋亡细胞。给药组可以看到细胞出现凋亡现象，凋亡细胞的细胞核固缩，染色质凝集或核片段形成凋亡小体;阴性对照组SK-OV3细胞着色均匀，细胞结构清晰，旋覆花素组可见细胞核浓染或片状，可见染色减弱的坏死细胞形态;阴性对照组Hela细胞结构无明显变化。

3 讨论

细胞活力大多通过检测两个特征参数来反映，即细胞代谢活力和细胞膜的完整性。代谢旺盛的细胞可以将四唑蓝如MTT等代谢为紫色/深棕色产物，用代谢产物的光密度值可以定量反映细胞的代谢活力［5］。本试验通过MTT法检测细胞的存活和生长，并计算药物的IC50值，通过IC50值的大小来制定药物作用的强弱和特异性，结果表明，旋覆花素在体外具有一定的抗肿瘤作用且有一定的选择性，对人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用较差，对小鼠肝癌H22细胞株、小鼠肉瘤S180细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人卵巢癌SK-OV3细胞株作用强，而且，旋覆花素对这四种细胞的生长抑制作用随剂量的增加而增高，有剂量依赖关系。凋亡和坏死是药物引起肿瘤细胞死亡的两种主要方式［6，7］，旋覆花素对细胞的生长抑制作用是否也是通过诱导凋亡和引起细胞死亡实现的。本试验中，我们在倒置显微镜下及激光共聚焦显微镜下看到旋覆花素可引起肿瘤细胞死亡，和旋覆花素对肿瘤细胞的抑制率结果一致，镜下结果显示，H22细胞、S180细胞、A549细胞和SK-OV3细胞经旋覆花素作用后出现明显的细胞死亡，但Hela细胞死亡较少。进一步从激光共聚焦的结果可以看到，旋覆花素对肿瘤细胞的生长抑制作用与其诱导凋亡和引起坏死有关。这些结果为旋覆花素用于抗肿瘤作用提供依据，但其应用需要整体动物实验的支持。

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