2006至2009年保定市儿童医院产超广谱β-内酰胺酶表型及基因型分布的研究

王美英

三代头孢菌素如头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶和单环酰胺类抗生素如氨曲南在临床上广泛应用，导致对这类抗生素耐药的细菌不断增多，其主要机制是细菌产生了能水解氧亚氨基β-内酰胺抗生素的超广谱 β-内酰胺酶(extended-epectrum βlactamases，ESBLs)。产ESBLs菌常具多重耐药性，易导致医院内的暴发流行，且流行状况及耐药性存在地区差别，并对三代头孢菌素表现敏感而误导治疗，故被认为是革兰阴性菌中最危险的耐药形式。因此，了解我市儿科患者分离的肠杆菌科细菌中ESBLs的流行和分布情况，以及产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型别及最佳检测底物及耐药性特点，从而防止产

ESBLs株的区域性流行，指导临床治疗，以免延误病情和造成浪费。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株:2006年1月至2009年12月，河北省保定市儿童医院患者标本中分离出的耐药性肠杆菌科细菌。ESBLs敏感菌标准菌株大肠埃希菌ATCC 25922，ESBLs检测质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603(产超广谱β-内酰胺酶菌株)

1.1.2 试剂:革兰阴性杆菌培养基:中国兰琼脂平板(英国Oxoid公司)。药敏M-H琼脂培养基(英国Oxoid公司)。营养肉汤(英国Oxoid公司)。

1.1.3 主要仪器设备及器械:全自动血培养仪(法国生物梅里埃公司);VITEK 2全自动微生物鉴定仪(法国生物梅里埃公司);PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司);水平凝胶电泳槽(日本ATTO公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离、培养、鉴定:所有标本按常规接种，VITEK2全自动微生物分析仪鉴定。

1.2.2 ESBLs表型筛选试验:选用头孢泊肟(CPD)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、胺曲南(ATM)、头孢曲松(CAX)药敏纸片(均 30 μg/片)，用 Mueller-Hinton琼脂，改良 Kirby-Bauer纸片扩散法测试抑菌环直径。凡头孢泊肟或头孢他啶的抑菌环直径≤22 mm，或头孢曲松≤25 mm，胺曲南或头孢噻肟≤27 mm，均应高度怀疑为产ESBLs菌株，需进一步做确证试验来加以确证。

1.2.3 ESBLs表型确证试验:按1999年1月NCCLS推荐的标准纸片扩散确证法测定ESBLs指南操作，用CAZ(30 μg/片)和CAZ+CAZ/CLV(30 μg/10 μg)组合、CTX(30 μg/片)和 CTX+CTX/CLV(30 μg/10 μg)组合，分别测量2种纸片加 CTX/CLV后的抑菌环直径。对2个中任何一个药物加CTX/CLV后抑菌环的直径差≥5 mm时，可确认为产ESBLs菌株。

1.2.4 ESBLs基因 PCR 扩增

1.2.4.1 DNA模板制备:用于扩增整合子的整合酶及相关基因盒的模板制备方法。如下:挑取单个菌落置入内含150 μl裂解液(0.5%非离子去污剂NP40配制的浓度为200 ng/ml蛋白酶K溶液)的0.5 ml离心管内，置55℃水浴消化1 h。然后置95℃水浴灭活15 min。14 000 r/min离心30 s。吸取上清液，即为基因扩增检测的模板液。

1.2.4.2 聚合酶链反应(PCR):①采用25 μl反应体系扩增目的基因，引物序列见表 1;②TEM-1、SHV-11、OXA-10、CTX-M-3为阳性对照，大肠埃希菌(ACTT 25922)为阴性对照;③TEM、SHV、OXA、VEB和PER基因扩增的循环参数均为94℃预变性3 min;94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，循环 35 次;最后72℃延伸10 min。CTX-M基因扩增的退火温度为50℃，其余参数不变。

1.2.4.3 电泳:反应产物5 μl与1 μl 6 × 嗅酚蓝上样缓冲液混合点入1.0%琼脂糖的点样孔中，1×TAE中100 V电泳35 min，溴化乙啶染色(0.5 μg/ml)30～40 min后在紫外灯下观察结果并摄像。设ECO ATCC 25922及空白为阴性对照，标准产酶ECO(TEM、SHV-2、SHV-7、SHV-12、CTX-M)分别为阳性对照。

表1 PCR扩增ESBLs基因引物名称引物序列片段长度

2 结果

2.1 ESBLs表型试验结果 见表2。

表2 1 677株细菌的ESBLs检测

2.2 PCR扩增结果 见表3、4。

表3 750株产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型株(%)

表4 750株产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型分布 株

3 讨论

广谱抗生素特别是三代头孢菌素在临床上的广泛使用，使得质粒介导的产ESBLs细菌在我国不同地区广泛传播［1］。产ESBLs细菌不仅对三代头孢类抗生素均耐药，而且由于细菌携带ESBLs质粒可同时带有对喹诺酮类、胺基糖甙类和磺胺类等多种抗生素的耐药基因，致使产ESBLs细菌具有多种不同的耐药表型。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌最为常见。近年来，产ESBLs的菌株呈逐年增加的趋势，叶素娟等［2］报道，国内8所较有代表性的综合性医院2005年临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的检出率分别为38.9%、40.5%，不同医院ESBLs检出率不尽相同，其耐药性明显高于非产ESBLs株。本组资料显示，我院产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率为45.4%、43.9%。一般认为碳青霉烯类、头霉(类抗生素以及β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸等可用于治疗产ESBLs细菌所致感染。本组资料药敏结果也显示，产ESBLs菌株对亚胺培南全部敏感，故碳青霉烯类抗生素可作为治疗危重患儿的首选药物，对头孢西丁、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和阿莫西林/克拉维酸保持较低的耐药率，亦可作为治疗产ESBLs细菌引起感染的理想药物;但产ESBLs菌株对氨苄西林/舒巴坦的耐药率为44.3%，应根据药敏结果使用;在本组资料中，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对环丙沙星的耐药率为30%，低于报道［2］，可能此类抗菌药物对儿童不良反应较多，儿童感染患者较少单独使用有关;同时显示大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率明显高于肺炎克雷伯菌。国内许多研究显示，主要流行的ESBLs基因型为CTX-M型，但流行的亚型不尽相同，如叶惠芬等［3］报道，流行的ESBLs基因型主要是 CTX-M-14 和 SHV-12;韩珍等［4，5］报道，北京医院和浙江地区主要为CTX-M-14，其次为SHV型，TEM型均为TEM-1型。本试验显示我院流行的ESBLs基因型主要为CTXM型，且以CTX-M-14基因型最多，，SHV基因型中SHV-5最多，本研究结果显示，共检出8种ESBLs基因型;750株产ESBLs细菌中，57.3%(430/750)菌株产单一基因型，42.7%(320/750)的菌株产2种或2种以上的基因型。ESBLs亚型在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分布存在差异，SHV型几乎全部来自于肺炎克雷伯菌，CTX-M型主要出现在大肠埃希菌。CTX-M型菌株对CTX的耐药率明显高于SHV型，CTX-M型ESBLs最主要的特点是高度水解CTX，而2种细菌对CTX的耐药表型显示耐药率差别不大，此种差别可能是产ESBLs肺炎克雷伯菌中有22%的菌株为产CTX-M+SHV型基因，保定市尚未见ESBLs基因型方面的报道。值得注意的是TEM、SHV、CTX-M、OXA型基因双阳性及3阳性的比率高达50%，原因可能为:质粒上有≥2种ESBLs的编码基因或产ESBLs菌株同时产TEM-1、TEM-2或SHV-1型广谱酶，这一现象有待于将来进一步深入探讨。

1 常殿武，李明成.儿科院内感染肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰酶基因型检测及分析.山东医药，2008，48:71-72.

2 叶素娟，杨青，俞云松.2005年中国CHINET大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性分析.中国感染与化疗杂志，2007，7:283-286.

3 叶惠芬，陈惠玲，刘平，等.产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性和基因型分布.中国感染与化疗杂志，2007，7:127-129.

4 韩珍，李向阳，杨锦红，等.临床产ESBLs大肠埃希菌耐药表型及基因型的研究.检验医学，2008，23:397-340.

5 季淑娟，陈亚岗，俞云松，等.浙江省产广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因分型.中华传染病杂志，2005，23:75-78.