杨慧芳
心肌细胞内向整流钾电流Kir主要参与心肌细胞动作电位的4级静息电位过程,与心肌细胞动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)的长短密切相关,对维持心肌细胞正常生理功能有重要的作用,IK的异常也常常是心律失常的因素之一[1]。IK主要维持心肌细胞的静息膜电位,是动作电位的重要组成部分,是维持心室肌细胞正常功能活动的重要电流。本文研究小鼠心肌细胞内向整流钾电流Kir2.1的在静息膜电位中的参与与在所有内向整流钾电流中所占比例。
1.1 实验动物 豚鼠8只,体重200~250 g。本实验中豚鼠由河北医科大学动物实验中心提供。
1.2 试剂与溶液
1.2.1 试剂:Ⅱ型胶原酶(collagenase typeⅡ)为 GIBCO公司生产,其他试剂均为国产分析纯。
1.2.2 溶液:①无钙台氏液:NaCl 137.7 mmol/L,NaOH 2.3 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,MgCl 21 mmol/L,N-(乙羟乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)5 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L(用NaOH调 pH 值 至 7.4);②KB 液:KCl 83 mmol/L,K2HPO430 mmol/L,MgSO45 mmol/L,KOH 2 mmol/L,丙 酮 酸 钠5 mmol/L,牛 磺 酸 20 mmol/L,葡 萄 糖 10 mmol/L,EGTA 0.5 mmol/L,HEPES 5 mmol/L,(用 KOH 调 pH 值至 7.2);③记录Kir2.1的电极内液;④记录 Kir的电极外液:NaCl 150 mmol/L,KCl10 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L,MgCl25.4 mmol/L,用NaOH调pH值至7.4。
1.3 仪器 膜片钳放大器Axon 200B为美国Axon公司产品;电极拉制器和三位操纵器均为Sutter公司产品;倒置显微镜TE2000-S为Nikon公司产品。
1.4 方法 豚鼠心肌细胞的急性分离:将豚鼠麻醉后快速开胸取出心脏,至于冰无钙台式液中进行主动脉插管,连于Langendorff灌流装置上,进行恒压恒温逆行灌流。灌流液温度37℃,流速7 ml/min,用前用100%O2饱和。先用无钙台氏液灌流5 min,冲洗心脏中残留的血液,然后灌以含12 mg/mlⅡ型胶原酶的无钙台氏液,循环灌流心脏1 520 min,之后再用无钙台氏液灌流,以冲洗心脏中残留的胶原酶。将消化后的心肌剪下,置于KB液中剪碎,轻轻吹打至细胞分散。待细胞沉降后置换KB液,室温下静置1 h后用于膜片钳记录。
1.5 膜片钳记录 实验采用标准全细胞膜片钳方法记录心肌细胞Kir2.1电流。将部分静置的细胞放入浴槽中,待细胞贴壁后灌以外液。应用电极拉制仪将薄细毛坯电极拉制成应用电极并抛光待用。将电极接触与细胞表面给予一定负压,在细胞膜表面与电极尖之间形成紧密的封接,达GΩ。施加更大的负压使细胞膜破膜,补偿电极电容和串联电阻,达到全细胞记录模式(whole-cell recording)。记录豚鼠心室肌细胞Kir2.1电流,并给予500 mmol/L BaCl2溶液,观察与记录Kir2.1的变化,并统计Kir2.1在心肌细胞内向整流钾离子电流中所占比例。
1.6 统计学分析 应用Clampfit 9.0(美国Axon公司)和Origin 7.0统计软件,实验数据以±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 Ba2+对IKir2.1的作用 应用全细胞膜片钳记录Ba2+对豚鼠心肌细胞中Kir2.1的作用。全细胞记录Kir2.1的protocol是采用牵制电压为-120 mV逐渐升至40 mV再回到-120 mV。IK的电压依赖性研究应用牵制在-80 mV,再阶跃到80 mV,再回到 -80 mV,依次从80 mV以10 mV降低至-30 mV。记录到IKir2.1明显被抑制,抑制率为(81±7)%。见图1。
2.2 Ba2+抑制豚鼠心肌细胞Kir2.1的统计 见图2。
图1 500 mmol/L的Ba2+对Kir2.1 的作用
图2 Ba2+抑制豚鼠心肌细胞统计图
Kir2.1主要分布于心肌细胞,对维持心肌细胞的静息电位以及心肌复极过程起着重要的作用。其异常是导致心律失常的重要机制之一,同时也是导致其他器官异常的重要因素,例如它参与帕金森病形成等[1],国内外研究人员对于Kir2.1的调节机制研究已经有很多的基础。对于心肌细胞内向整流钾电流中Kir2.1所占比例,有诸多的研究[2]。心肌细胞的内向整流钾离子电流由多种钾离子电流组成,心肌细胞的内向整流钾离子电流由多种钾离子电流组成,在心脏的生理活动中起举足轻生的作用[3-5],本文主要研究Kir2.1对豚鼠心肌细胞内向整流钾离子组成的贡献。通过实验研究,我们发现Kir2.1在豚鼠心肌细胞中所占比例,即被Ba抑制的电流比例,为(81±7)%。说明Kir2.1是心肌细胞内向整流钾离子电流的主要组成部分,并且还有其他的电流组成部分,他们在维持心肌细胞的正常生理功能方面起着重要作用。
1 Regina PM,Günter S,Tobias G,et al.Heteromerzation of Kir2.x potassium channels contributes to the phenotype of Andersen’s syndrome.Physiology,2002,99:7774-7779.
2 GX Liu,C Derst,G Schlichthrl,et al.Comparison of cloned Kir2 channels with native inward rectifier K+channels from.Physiol,2001,532:115-126.
3 Jongsma HJ,Wilders R.Channelopathies:Kir2.1 mutations jeopardize many cell functions.Curr Biol,2001,11:R747-750.
4 Abraham MR,Jahangir A,Alekseev AE,et al.Channelopathies of inwardly rectifying potassium channels.FASEB J,1999,13:1901-1910.
5 He Y,Pan Q,Li J,et al.Kir2.3 knock-down decreases IK1 current in neonatal rat cardiomyocytes.FEBS Letters,2008,582:2338-2342.