匹鲁卡品癫痫模型慢性期大鼠海马苔藓纤维出芽的观察

陈丽丽 黄 靓妹 詹 红艳 曹亦宾

实验动物模型是研究癫痫的重要手段。研究发现，腹腔注射匹鲁卡品(pilocarpine，PILO)是诱导癫痫发作的一种简单方便的动物模型［1，2］。PILO通过同时激动乙酰胆碱和谷氨酸受体导致大鼠癫痫发作。发作后可引起分为3个阶段的行为和脑电图变化:急性期:边缘性癫痫持续状态(status epilepsy，SE)可持续至24 h;静止期:脑电图(EEG)和行为基本正常，4～42 d;慢性自发性复发性发作(spontaneous recurrent seizures，SRS):类似于复杂部分性发作的患者，每只动物发作2～3次/周［3］。长期发作可引起类似人类颞叶癫痫的病理改变，如神经元缺失、胶质细胞增生、苔藓纤维出芽等［4，5］。因此，该模型已作为理想的动物模型之一，用于癫痫的实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性成年Wistra大鼠60只，体重200～250 g，由河北联合大学动物实验部提供。随机分为2组，癫痫模型组(模型组)30只;0.9%氯化钠溶液对照组(对照组)30只。均进行Nissl染色及Timm银染。

1.2 药品 PILO由美国SIGMA公司提供，硝酸银由广州市立新化工厂生产，戊巴比妥钠由北京化工厂生产，焦油紫(Crestyl Violet)由美国SIGMA公司生产，氢醌由湖北大学化工厂生产。

1.3 动物模型制作 大鼠腹腔注射PILO 350 mg/kg，注入前30 min腹腔注入东莨宕碱1 mg/kg，以拮抗其外周胆碱能反应;注射后根据Racine［6］制定的标准判定是否有癫痫发作，并于实验当天行EEG检查。对照组大鼠腹腔注等量0.9%氯化钠溶液，观察有无癫痫发作，也于实验当天行EEG检查。Racine标准:0级无惊厥、Ⅰ级面部阵挛、Ⅱ级面部阵挛+节律点头、Ⅲ级面部阵挛+节律点头+前肢阵挛、Ⅳ级面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立、Ⅴ级面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒。

1.4 灌注和取材 模型组及对照组用于Nissl染色的大鼠分别于给药后3、7、10、30、60 d 灌注取材;用于 neo-Timm 染色的大鼠分别于 3、7、10、30、60 d 灌注取材。

1.5 Nissl染色 切片置于二甲苯中脱脂3 min后依次放入100%、95%、70%乙醇各3 min加水，蒸馏水漂洗3 min，0.1%Crestyl Violet染色10～20 s，镜下观察背景呈白色或无色;而后依次放入70%、95%、100%乙醇各1～2 min脱水，再移入二甲苯透明至少5～10 min后，中性树胶封片;Olympus光学显微镜观察，并拍照。半定量评估CA1、CA3、门区神经细胞丢失程度，评分标准［7］0:无损害;1:1% ～10%神经元缺失，伴轻度轴突变性;2:11% ～50%细胞缺失，伴相当多的纤维变性;3:超过50%的细胞缺失，伴密集延长的轴突变性。

1.6 Timm银染 将50%阿拉伯胶60 ml柠檬酸缓冲液10 ml、5.6%氢醌 30 ml、17%硝酸银 1.5 ml于暗室中混合均匀［8］;暗室中将干燥切片浸入新鲜配制的孵育液后，置26℃水浴箱中孵育1 h以上后，倾去孵育液，流水冲洗15～20 min;切片干燥后，行Nissl复染(同前)，中性树胶封片;光镜下行齿状回颗粒上区Timm银染苔藓纤维出芽评分，评分标准［9］见表1。

1.7 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，每只大鼠的各项数据均采用盲法对每只动物的5张切片进行平均后产生，计量资料以±s表示，半定量评分比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 颗粒上区苔藓纤维出芽Timm银染颗粒评分标准

2 结果

2.1 动物行为学观察及脑电图 模型组:PILO给药的30只大鼠中，1只死于癫痫持续状态，其余大鼠均可观察到边缘性发作行为表现，即竖立、奔跑、湿狗样抖动，继发以面部自动症如眨眼、咀嚼及点头。按Racine标准，Ⅱ～Ⅲ级发作2只，Ⅳ～Ⅴ级发作26只，未发作1只，每次发作持续约40 s，连续5～24 h。给药3 d后及60 d内行为表现呈慢性复发性痫性发作，Ⅱ～Ⅲ级，2～3次/周，表现为前腭阵挛、咀嚼，单肢阵挛等，每次持续约20～30 s。模型成功率为93%。Ⅳ级以上脑电图均可见癫痫波(图1)。对照组:腹腔注射0.9%氯化钠溶液，30只大鼠未观察到边缘性发作行为表现及癫痫发作。

2.2 Nissl染色 正常大鼠CA3、CA1区有大量致密锥体细胞，齿状回门区有中等量神经元。本研究对照组各区神经元未见丢失与变形，与正常大鼠无差别。PILO注射3 d后，CA3区锥体细胞大量缺失伴细胞变性，CA1区锥体细胞也开始缺失;7 d后，可以观察到颗粒细胞发散并持续30 d，同时CA1区变性;30 d后，门区和CA1区可见大量胶质细胞增生;60 d时更明显(图2)。模型组各区神经元缺失情况。见表1。

表1 模型组海马各区神经缺失程度评分比较 分(张)

2.3 Timm银染 正常情况下，海马苔藓纤维(mossy-fibre，MF)终止于CA3区锥体层和门区神经元，并有大量Timm颗粒分布，齿状回颗粒上区只有极少量Timm颗粒分布。本研究所有对照组大鼠切片颗粒上区均未见苔藓纤维着色，也未见Zn2+标记的苔藓纤维末梢增加(图3)。模型组PILO注射10 d后，多数大鼠门区观察到富含Zn2+的苔藓纤维并伸向CA3区，并可见单独的苔藓纤维穿过颗粒细胞后进入内分子层，但与同期对照组染色无差别;30 d后几乎所有大鼠内分子层均见富含Zn2+的苔藓纤维末梢;60 d后，苔藓纤维出芽非常明显，内分子层可清楚地看到含Zn2+末梢并形成异常带，分子层外2/3未见Timm颗粒带形成(图4)。模型组与对照组苔藓纤维出芽Timm银染颗粒评分比较，差异有统计学意义(u=－3.365，P＜0.05)。见表2。

3 讨论

3.1 神经元丢失 正常海马结构中CA1和CA3区主神经元为锥体细胞，齿状回主神经细胞为颗粒细胞，门区主神经元为中间神经元。从CA1经CA3至门区，神经元形态和电生理特点呈连续变化过程，细胞自发放电增加，抑制性中间神经元的作用逐渐减弱。而齿状回颗粒细胞则不同，生理条件下齿状回具有防止癫痫样电活动在海马网络中的发生的作用。大量实验证明成年动物癫痫持续状态可引起海马CA1、CA3区和齿状回门区神经元的丢失，齿状回颗粒上区和CA1区锥体下层颗粒细胞轴突(苔藓纤维)外生(出芽)［10，11］。本研究观察了大鼠腹腔注射PILO后海马各区神经元的丢失情况。结果表明齿状回门区神经元、CA3锥体细胞大量丢失伴胶体细胞增生，CA1区锥体细胞少量丢失伴轻度变性及颗粒细胞发散，该结果与Cllifford等［4］研究基本一致。研究认为，海马CA1区和齿状回富含胆碱受体，CA3区和门区富含谷氨酸能受体，而癫痫发作后神经元丢失最严重的却是CA3区，其次是门区。神经元丢失可能是通过特异性递质受体(谷氨酸受体)介导，因为谷氨酸可引起神经元树突的肿胀，神经细胞体的水肿及变性。

表2 苔藓纤维出芽Timm银染颗粒评分 分(张)

图1 癫痫模型组脑电图

图2 PILO注射60 d门区神经元缺失伴胶质细胞增生

图3 癫痫对照组颗粒上区Timm银染

图4 PILO注射60 d颗粒上区Timm银染

3.2 苔藓纤维出芽 正常齿状回苔藓纤维起自颗粒细胞层，进入门区，其分支形成密集的网络。门区的轴突就近传至CA3区，终止于腔隙层而形成纤维束，在Timm银染时表现为Timm颗粒。光镜下见到的Timm颗粒已由电镜证实位于超微结构的突触末端［8］。苔藓纤维出芽是指在内分子层形成的神经可塑性改变，在切片上可见表现为Timm银染着色区的改变。齿状回内分子层苔藓纤维出芽是颞叶癫痫患者和颞叶癫痫动物模型一种重要的神经可塑性变化［12］。本实验中，PILO注射后10 d，可见单独的苔藓纤维穿过颗粒细胞层进入内分子层;30 d后，几乎所有大鼠内分子层均见富含Zn2+的苔藓纤维末梢;60 d后，在内1/3分子层形成异常带。切片上表现为Timm银染着色区域的变化，由苔藓纤维出芽和突触重建产生。Tang等［13］研究表明，齿状回门区苔藓细胞的丢失与苔藓纤维出芽有关，齿状回门区神经元是一组对兴奋性毒性易损性神经元，由不同的神经元群组成，其中最主要的是苔藓细胞，苔藓细胞死亡，使得内分子层颗粒细胞树突的突触后位点空隙，刺激了苔藓纤维并形成新的兴奋突触环路，该环路产生正反馈而引起自发性癫痫发作。进一步研究发现，在PILO模型中，神经元丢失、癫痫持续状态、苔藓纤维出芽的密度和自发性癫痫发作的频率有明确的相关性［14］。更进一步研究结果表明，中度海马苔藓(MF)出芽可由未产生神经元损害的短期发作引起，而红藻氨酸(KA)或点燃模型中见到的严重苔藓纤维出芽可能是由长期的发作活动和神经元缺失共同产生。

综上可见，腹腔注射匹鲁卡品简单复制了人类癫痫的基本病理特征，是研究癫痫的一种简便方法。

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