柱前衍生高效液相色谱法测定乳与乳制品中羟脯氨酸的含量

北京市饲料监察所 魏秀莲 丁美方 董颖超 杨定忠

皮革水解蛋白是利用皮革下脚料经水解而生成的蛋白质混合物，其主要成分为胶原蛋白。由于皮革下脚料中含有大量皮革糅制及染色过程中添加的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，因此用这种原料生产水解蛋白，皮革中的重铬酸钾和重铬酸钠自然就被带入产品中。如果长期食用含有“皮革水解蛋白”的食物，“铬”重金属离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡。卫生部最新引发了《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》，明令禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白与三聚氰胺不同，是真正的蛋白质，因此若被添加到食品中，检测难度高于三聚氰胺。皮革水解物主要添加的食品是乳与乳制品及含乳饮料，作用是增加蛋白质含量。由于羟脯氨酸具胶原蛋白的特有组分，其含量占胶原蛋白10%以上，而乳蛋白中不含此成分，因此通过测定样品中的羟脯氨酸，则可以判断样品中是否添加了皮革水解蛋白。关于动物组织及其他相关产品中羟脯氨酸的液相检测方法已有报道（崔勇等，2008；郑家概等，2008；孙光臣和刘英芹，2004），而关于乳及乳制品中的羟脯氨酸的检测，尚未见报道，本文建立了测定乳与乳制品中羟脯氨酸的柱前衍生高效液相色谱法（HPLC）。

1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；氮吹仪（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

羟脯氨酸对照品、正亮氨酸对照品、异硫氰酸苯酯（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；乙腈为色谱纯（美国Honeywell公司），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Agela Venusil-AA氨基酸分析专用色谱柱 （天津博纳艾杰尔科技有限公司）；流动相A：称取无水醋酸钠 8.2 g，加水800 mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至 1000 mL，加乙腈 75 mL，混匀，用 0.45 μm 滤膜过滤；流动相B：80%乙腈（V/V）；梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速：1 mL/min；柱温40℃；进样量 50 μL。

表1 梯度洗脱程序表

2.2 溶液的配制 0.1 mol/L盐酸溶液：量取8.3 mL浓盐酸，加水稀释至1000 mL。6 mol/L盐酸溶液（含0.1%苯酚）：称取苯0.1 g，加浓盐酸50 mL和水50 mL溶解，混匀。12 mol/L盐酸溶液（含0.1%苯酚）：称取苯酚0.1 g，加浓盐酸100 mL溶解，混匀。正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10 mg，加0.1 mol/L盐酸溶液 10 mL使溶解，混匀。三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混匀。异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混匀。羟脯氨酸（C5H9NO3）标准储备液 500 μg/mL:称取 50.0 mg羟脯氨酸用0.1 mol/L盐酸溶解并，定容至100mL容量瓶中。 标准工作液25 μg/mL:吸取标准储备液5.00 mL置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容至刻度，混匀，准确量取1.0 mL，置1.5 mL塑料离心管，准确加入正亮氨酸内标溶液 100 μL，混匀。

2.3 样品水解 皮革蛋白粉的水解：准确称取皮革蛋白粉10～20 mg，将称好的样品放于10～20 mL水解管中，加入5 mL含0.1%苯酚的6 mol/L盐酸，振摇使样品溶解或使样品均匀分散于溶液中，将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5 min（或置-20℃冰箱中冷冻），用氮气置换空气后在充氮气状态下拧紧螺丝盖，将已封口水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内，水解24 h，取出冷却。打开水解管，将水解液全部转移至25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容，混匀，过滤，取滤液，作为衍生用样品溶液。

纯牛奶和皮革奶的水解：准确称取纯牛奶和皮革奶约3 g，分别置于10～20 mL水解管中，每管加入3 mL浓盐酸（含0.1%苯酚），将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5 min（或置-20℃冰箱中冷冻）。其余步骤同固体样品水解过程。

2.4 样品衍生 准确量取衍生用样品溶液1.0 mL，置玻璃管中，准确加入正亮氨酸内标溶液100 μL，用真空干燥器在40～50℃真空干燥或用氮吹仪吹干除去盐酸后，加1.1 mL 0.1 mol/L盐溶液重新溶解，混匀，量取220 μL，置1.5 mL塑料离心管中，往离心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液 100 μL，混匀，室温放置1 h，然后加入正己烷800 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，用 0.45 μm 小滤器过滤，取滤液适量，用水稀释5倍后上机分析。另取羟脯氨酸标准工作液220 μL，按上述方法衍生处理。

3 结果与讨论

3.1 色谱行为及专属性实验 从图1可以看出羟脯氨酸与其他氨基酸得到很好的分离，与前后氨基酸的分离度大于8.5，表明本方法具有良好的专属性。

3.2 线性范围及检测下限 精密吸取羟脯氨酸标准储备液适量，配制成羟脯氨酸浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.3125、0.078125 μg/mL的系列样本， 按 2.4制备对照品溶液，并进行色谱分析，以羟脯氨酸峰面积（Y）对浓度 （X）进行线性回归得Y=0.0317 X-0.5561（r＝1），以羟脯氨酸峰面积与内标峰面积的比值（Y）对浓度（X）的进行线性回归得Y=101.87X-0.4124（r＝1），结果表明在 0.08 ～ 200 μg/mL 的浓度范围内，羟脯氨酸的浓度与峰面积间具有良好的线性关系，相关系数r=1。羟脯氨酸的最低检出限为 0.014 μg/mL（S/N=3），定量限为 0.046 μg/mL（S/N=10）。

图1 19种氨基酸高效液相色谱图

3.3 重复性实验 取6.25 μg/mL的羟脯氨酸标准溶液衍生物重复进样6次，保留时间及峰面积的RSD分别为0.07%和0.22%，表明该方法具有良好的重复性。

3.4 稳定性实验 取6.25 μg/mL的羟脯氨酸标准溶液衍生物，按上述色谱条件分别在0、8、16、24、32、48 h测定，羟脯氨酸峰面积，内标物峰面积及羟脯氨酸峰面积与内标峰面积的比值的RSD分别为0.43%、0.06%、0.43%，结果表明羟脯氨酸衍生物具有较好的稳定性，至少可稳定48 h。

3.5 回收率实验 分别取高 （50 μg/mL）、中（31.25 μg/mL）、低（12.5 μg/mL）三个浓度进行空白加样回收实验，回收率为98.2%～99.0%。结果见表2。

表2 回收率测定结果表

3.6 样品测定 按上述水解、衍生化及色谱条件对皮革奶，皮革水解蛋白粉和市售纯牛奶进行测定，测定结果见表3。

表3 样品测定结果表

图2 样品高效液相色谱图

4 讨论与结论

本实验建立了柱前衍生高效液相色谱法测定乳与乳制品中皮革水解蛋白特征性成分羟脯氨酸含量的方法，高中低浓度加样回收范围98.2% ～99.0%。此法简单易行，准确度高，样品中各氨基酸分离度好，乳、乳制品及皮革水解蛋白粉中内源性物质对羟脯氨酸含量测定没干扰，适用于乳及乳制品中羟脯氨酸的测定。本方法通过对羟脯氨酸含量的测定，可判定乳与乳制品制品中是否添加了皮革水解蛋白，为皮革奶检测提供实验依据。

[1]崔勇，刘智，张博，等.反向高效液相色谱柱前衍生化法测定保健食品中羟脯氨酸的含量[J].中国卫生检验杂志，2008，18（11）：2247 ～ 2249.

[2]郑家概，王飞，农云军，等.柱前衍生高效液相色谱法对动物组织中胶原蛋白的测定[J].分析测试学报，2008，27（12）：1383 ～ 1385.

[3]孙广臣，刘英芹.高压液相色谱法测定肾脏组织羟脯氨酸含量[J].黑龙江医药科学，2004，27（5）：79 ～ 80.