NSCLC组织中MGMT过甲基化状况与临床病理特征的关系探讨

亢春彦,陶志敏,肖 红,张秀芝,薛玉仙

(1.河南职工医学院病理学教研室,河南 郑州451191;2.河南大学护理学院)

近年来随着遗传学的兴起与发展,人们发现在肿瘤的发生发展中,基因的过甲基化是一个重要事件,甚至有可能是恶性肿瘤形成的早期事件,而且是肿瘤特有的[1]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)是人类DNA修复系统中最重要的直接修复酶,在抵御烷化剂所致的细胞突变和死亡中起重要作用[2]。目前已有许多研究证实MGMT过甲基化的检测有助于肿瘤的早期诊断及预后判断[3、4]。本研究观察了MGMT过甲基化与非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)临床病理特征的关系,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料以2006年3月到2009年7月在河南省胸科医院胸外科手术治疗的77例肺癌患者作为研究对象,归入研究组,包括男53例,女24例,年龄35-70岁,平均52.3±2.5岁,所有患者肺部病变组织标本均经病理诊断为NSCLC且术前均无化疗及放疗史。另外选取20例肺良性病变患者作为对照组,包括男12例,女8例,年龄33-68岁,平均50.1±2.2岁,肺部病变组织标本均经病理证实为正常肺组织。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取和修饰 DNA提取试剂盒购自上海生工生物有限公司,按试剂盒推荐方法进行DNA的提取。以紫外光分光光度仪测浓度并计算其含量,取1μ gDNA并参照说明书步骤采用亚硫酸氢钠修饰试剂盒进行修饰,使DNA序列中的非甲基化胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),甲基化的C则不变,在随后的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)反应中U变为胸腺嘧啶(T)。

1.2.2合成引物 根据亚硫酸氢钠修饰后非甲基化和甲基化DNA序列改变的不同设计并合成两对引物 。(1)非甲基化引物:上游 5′-AACTCCACACTCT TCCAAAAACAAAACA-3′,下 游 5′-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′;(2)甲基化引物 :上游 5′-TTTCGACGTTCGT AGGTTTTCGC-3′,下游 5′-CACTCTTCCGAAAACGAAACG-3′。

1.2.3甲基化特异性PCR 甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)反应试剂盒 25 μ l(购自Qigen 公司)包含:模板 DNA0.1 μ g,1.0 μ mol/L 的引物各0.5 μ l,1.25 mmol/L的三磷酸核苷(nucleoside triphosphate,NTP)0.5 μ l,1.5 U Taq 聚合酶以及MSP专用缓冲液。两对引物分别用于扩增MGMT基因5′CpG岛甲基化和非甲基化的等位基因,产物长度分别为81和93 bp。反应条件分别为95℃变性5 min,然后 95℃30 s,58℃(甲基化)、59℃(非甲基化)30s,72℃30 s,40个循环后72℃延伸7min。为保证检测的可靠性,以经SssⅠ酶处理的和未经SssⅠ酶处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作为MGMT基因启动子甲基化的阴性和阳性对照。

1.2.4凝胶电泳分析 以去离子水为空白对照,取10 μ l扩增产物,用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定,溴化乙啶染色,用凝胶电泳成像仪进行拍照分析。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析,计数数据用百分数表示,采用 χ2检验,以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1两组MGMT基因甲基化状态比较MSP方法分析结果显示:研究组有26例出现MGMT基因甲基化,发生率为33.8%,对照组无1例出现MGMT基因甲基化,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2NSCLC组织中MGMT过甲基化状况与临床病理特征的关系从表1可知:NSCLC组织中MGMT过甲基化率在有吸烟史、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ期和分化程度为低分化时均显著升高,与相应的无吸烟史、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ-Ⅱ和分化程度为高、中分化比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

本研究中,77例NSCLC中有26例出现MGMT基因甲基化,发生率为33.8%,与Brabender[5]等人报道的38%的发生率相近,而对照组则无1例出现,提示MGMT基因过甲基化与NSCLC的发生有关。此外,结合77例NSCLC患者的临床病理特征进行分析后显示:NSCLC中MGMT过甲基化状态与有吸烟史、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ期和分化程度为低分化有关,提示MGMT基因过甲基化与NSCLC的发展有关,这也与国外文献[6]结果相吻合,表明MGMT的过甲基化参与了与肿瘤的恶性侵袭。

表1 NSCLC组织中MGMT过甲基化状况与临床病理特征的关系

综上所述,MGMT基因作为机体内一种重要的维持DNA完整性的修复基因,其异常甲基化状况可能与肺癌的发生、发展相关,加强对MGMT基因甲基化的基础和临床研究将会在未来的临床工作中为NSCLC的筛查、早期诊断、风险评估及预后判断提供有价值的信息。

[1]Duffy M J,Napieralski R,Martens J W,et al.Methylated genes as new cancer biomarkers[J].Eur J Cancer,2009,45(3):335.

[2]SafarA M,SpencerH,Su X,et al.Promoter hypermethylation for molecularnodal staging in non-small cell lung cancer[J].Arch Pathol Lab Med,2007,131(6):936.

[3]孔云明,金永堂,薛绍礼,等.NSCLC患者血浆p16和MGMT基因甲基化检测及临床意义[J].肿瘤,2007,27(9):715.

[4]杨振华,蔡映云,孙丽华,等.非小细胞肺癌11个肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化的研究[J].临床内科杂志,2005,22(10):708.

[5]Brabender J,Usadel H,Metzger R,et al.Quantitative O6-methylguanine DNA methyltransferase methylation analysis in curatively resected nonsmall cell lung cancr:associations with clinical outcome[J].Clin Cancer Res,2003,9(1):223.

[6]Furonaka O,Takeshima Y,Awaya H,et al.Aberrant methylation and loss of expression of O-methylguanine-DNA methyltransferase in pulmonary squamous cell carcinoma and adenocarcinoma[J].Pathol Int,2005,55(6):303.