血管生成素-1对HCT-8细胞的作用及其可能机制的研究

张继红,温春阳,于晓艳,李相军,尹 丽,任立群*

(1.吉林大学药学院,吉林 长春130021;2.北华大学附属医院;3.北华大学医学部)

近些年来,随着分子生物学的发展及对大肠癌的机制研究的不断深入,如何针对基因的靶向治疗已成为热点。Ang-1作为血管生成素(Ang)家族的一种,据国内外文献报道,主要是通过Ang-1/Tie-2信号系统促进血管内皮细胞的生存,起到抗凋亡的作用,但是对于此通路Tie-2后途径仍不清楚,据Kim[1]等研究推测,其抗凋亡的机理可能与PI3’-kinase/Akt调节的通路有关。我们应用Western blotting方法检测其对HCT-8细胞中的Tie-2、PI3K以及Akt三种蛋白的激活情况,并加入PI3’-kinase的抑制剂LY294002进一步检测三种蛋白的表达,旨在发现Ang-1对HCT-8细胞的作用及其分子机制,为大肠癌的分子靶向治疗提供一些参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人结肠癌细胞株HCT-8(北京药物研究所),DMEM培养基(Gibco),Ang-1(Pepretech),Western blotting检测试剂盒、LY294002、GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz),Tie-2多克隆抗体、PI3K多克隆抗体、Akt多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),即用型SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物工程公司),蛋白质marker(Solarbio),其余均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 细胞分组

1.2.1正常对照组(C组)用含15%胎牛血清的DMEM培养液培养。

1.2.2细胞凋亡组(0组)用无胎牛血清的DMEM培养液培养。

1.2.3血管生成素-1组(Ang-1组):在0组培养液基础上加入Ang-1(根据实验结果选定后续实验Ang-1的浓度为0.2 mg/L)。

1.2.4LY294002组(阻断剂LY294002+Ang-1组):在Ang-1组培养液基础上加入阻断剂LY294002。

1.3 MTT法检测条件培养基中细胞增殖情况

不同浓度的细胞消化后接种至6孔板。血清的培养基同步24 h后加入条件培养基,培养24 h后,组织细胞裂解液反复吹打,裂解后,加凝胶上样缓冲液,加热、离心,稀释后,于260 nm及 280 nm处测定吸光度值(A)。电泳,转膜后封闭PVDF膜,分别加入一抗、二抗,观察相应蛋白条带表达情况,用凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的密度值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1MTT法检测不同浓度的Ang-1蛋白对结肠癌细胞HCT-8生长的影响蛋白在浓度为0.05 mg/L时对结肠癌HCT-8细胞株即有抗凋亡作用,且随着浓度的增加抗凋亡作用平稳,根据实验结果选定后续实验Ang-1的浓度为0.2 mg/L(图1)。

图1 不同浓度的Ang-1对HCT-8细胞增殖的影响

2.2应用Western blotting蛋白免疫印迹法检测三种蛋白的表达见表1,图2、3。

表1 Ang-1对HCT-8细胞的抗凋亡作用

图2 HCT-8细胞中 Ang-1对 Tie-2、PI3K、Akt的激活及应用LY294002抑制剂后三者的表达

图3 a:0组与C组相比,P＜0.01;b:Ang-1组与0组相比,P＜0.01;c:Ang-1+阻断剂(LY294002组)与Ang-1组相比,P＜0.01

3 讨论

促血管生成素家族是近年来新发现的一种内皮细胞特异性的促血管生成因子(endothelium-specific proangiogenic factor)家族[2]。包括4种:Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,它们均属于酪氨酸激酶受体Tie-2的配基。Ang-1作为该家族中的重要一员,通过旁分泌的形式作用于血管内皮细胞[3],主要表达于血管周围细胞和壁细胞,是Tie-2最主要的激动剂,在血管新生及维持血管完整和稳定中起重要作用[4]。Stoeltzing等[5]应用重组Ang-1转染人结肠癌细胞HT29以评价Ang-1对肿瘤生长和血管形成的影响,结果提示,对于转移性结肠癌的病人,Ang-1可能起到抗肿瘤性药物或抗血管渗透性药物的作用。因此Ang-1作为抗肿瘤和抗血管通透性因子作用于转移性结肠直肠癌,有影响血管发生和血管通透性来阻止肿瘤转移的潜能。然而Ang-1在不同肿瘤中其表达并不一致,如在膀胱癌的血清中Ang-1明显高于非肿瘤组织和正常对照[6]。Tanaka等[7]研究发现:Ang-1在肝癌和正常肝组织中的表达无显著性差异。Alan[7]等研究发现Ang-1在胰腺肿瘤和正常胰腺组织中的表达无显著性差异。Tait[9]分析了56个公开发表的关于肿瘤组织中Ang表达情况的研究资料并发现,其中只有一半显示肿瘤组织中Ang-1表达有所上调。本研究中,无血清培养基培养的HCT-8细胞中加入较少浓度(0.05 mg/L)即出现细胞增殖,结果提示,外源性Ang-1促进HCT-8细胞的增殖,即具有抗凋亡作用,同时应用Western blotting蛋白免疫印迹法测定Tie-2抗体的表达降低,因此Ang-1对HCT-8细胞的抗凋亡作用可能是通过Ang-1/Tie-2途径实现的。

国内外文献对Tie-2的受体后途径还不清楚,Murakami T[10]等研究发现Ang-1通过P13K/AKT通路抑制氧化应激诱导的内皮细胞凋亡。Harfouche等研究发现,Ang-1可以通过抑制3磷酸激酶活性,抑制线粒体酶释放,上调生存蛋白等多个途径抑制内皮细胞的凋亡,而该作用也是通过Tie-2介导的[11]。Kim I等认为,Ang-1是由血管内皮细胞周围的支持细胞合成,通过旁分泌作用,与附近血管内皮细胞膜上的Tie-2受体特异性结合并使其磷酸化,通过磷脂酰肌醇3激酶(P13K)、蛋白激酶B(Akt)、粘着斑激酶(FAE)等信号途径[8,12,13],调节内皮之间、内皮-基质之间相互作用,促进血管成熟、稳定。本研究中,加入Ang-1蛋白,三种抗体Tie-2、PI3K、Akt的表达降低,结果提示,外源性Ang-1对HCT-8细胞的抗凋亡作用的实现可能是通过Tie-2/PI3K/Akt信号途径。

LY294002是 PI3K特异性阻滞剂,它可抑制PI3K而阻滞Akt的活性,从而阻滞了PI3K/Akt通路的信号转导,使P-gp不能磷酸化活化,不能发挥其药物泵作用,从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[14],逆转肿瘤细胞耐药。本研究中应用LY294002可以有效的降低Tie-2、PI3K和Akt的表达,更能进一步说明Ang-1对HCT-8的正调控效应,同时我们看到对Ang-1/Tie/Akt途径的阻断,可以有效地抑制HCT-8细胞的生长,达到治疗肿瘤的作用,从而为大肠癌的靶向治疗提供一些依据。当然由于LY294002不溶于水,具有细胞毒性,现在仅限于体外研究,临床应用受限,因此,在以后的研究中,可采用该途径的其他抑制剂如Akt抑制剂哌立福新(perifosine)等做进一步探讨。

[1]Kim I,Kim JH,Moon SO,et al.Angiopoietin-2 at high concentration can enhance endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt signal transduction pathway[J].Oncogene,2000,19:4549.

[2]杜 彬,周序珑.血管生成素的特点及其对血管新生的调节作用[J].中国病理生理杂志.2003,19(2):275.

[3]Fiedler U,Scharpfenecker M,Koidl S,et al.The Tie-2 ligand angiopoietin-2 isstored in and rapidly released upon stimulation from endothelial cellWeibel-Palade bodies[J].Blood,2004,103(11):4150.

[4]Zoya G,Belly K,Meir P,et al.Endothelial cells areactivated by angiopoeitin-1 gene transfer and producecoordinated sprouting in vitro and arteriogenesisin vivo[J].Biochemical and Biophysical Research Communica-tions,2007,359(2):263.

[5]Stoeltzing O,Ahmad SA,Liu W,et al.Angiopoietin-1 inhibits vascular permeability,angiogenesis,and growth of hepatic colon cancer tumors[J].CancerRes,2003,63:3370.

[6]Szarvas T,JgerT,Droste F,el al.Serum Levels of Angiogenie Factors and their Prognostic Relevance in Bladder cancer[J].Pathol Oncol Res,2008,20[Epnh ahead ofprint].

[7]Tanaka S,Mori M,Sakamoto Y,et al.Biologic significance of angiopoietin-2 expression in human hepatocellular carcinoma[J].J Clin Invest,1999,103:341.

[8]Kim I,Kim HG,Moon SO,et al.Angiopoiain-1 induces endothelial cell sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion[J].Circ Res,2000,86:952.

[9]Tait C R,Jones P F.Angiopoietins in tumours:the angiogenic switch[J].J Pathol,2004,204(1):1.

[10]Murakami T,Takagi H,Suzuma K,et al.Angiopoietin-1 attenuates H2o2-induced SEKI/JNK phosphorylation through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in vascular endothelial cells[J].J Biol Chem,2005,280(36):31841.

[11]Lafeur MA,Forsyth PFA,Atkinson SJ,et al.Perivascular cells regulate endothelial membrane type-matrix metal loproteinase activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,282:463.

[12]Kim I,Kim HG,So JN,et al.Angiopoietin-1 induces endothelial cell survival through the phosphatidylinositol-3,kinase/Akt signal transduction pathway[J].Circ Res,2000,86:24.

[13]Harfouche R,Hassessian HM,Guo Y,et al.Mechanisms which mediate the antiapoptotic effects of angiopoietin-1 on endothelial cells Microvasc Res,2002,64:135.

[14]夏 曙,于世英.抑制 PI3K/Akt信号转导通路提高化疗效果的实验研究[J].肿瘤,2006,26(4):311.