多囊肾小鼠肾功能的改变

陈 燕,郭宝锋,邵 晨,杨宝学,4,赵雪俭*

(1.吉林大学第一医院肾病科,吉林长春130021;2.吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室;3.吉林大学中日联谊医院急诊科;4.北京大学药理学教研室)

多囊肾脏组织特异性敲除小鼠(pkd1flox/-;Ksp-Cre Mouse,以下简称为PKD小鼠)只在肾脏发生囊泡,而其他组织器官未见异常。为探讨PKD小鼠肾功能在出生后随天数增加的变化情况,本研究室培育PKD小鼠,分别检测各时间点PKD小鼠及野生小鼠肾脏脏器系数,并应用尿素检测试剂盒对各时间点小鼠肾脏组织、血清中尿素含量进行检测。

1 材料与方法

1.1动物PKD小鼠由美国加州大学旧金山医学院医学系引进,在本中心稳定繁殖、传代,经基因组DNA鉴定确定小鼠的基因表型。

1.2肾脏组织的形态学检查取新鲜肾脏组织用10%福尔马林固定,石蜡包埋,切取4 μ m厚切片,常规脱蜡、脱水,HE染色,光镜下观察肾脏的病理改变并进行拍照。

1.3肾脏组织的脏器系数将各实验组小鼠称重,然后解剖小鼠取肾脏组织进行称重,计算公式:肾脏脏器系数=肾脏重量/小鼠体重。

1.4肾脏组织、血清中尿素含量的检测取肾脏组织进行组织匀浆后(1 mg/15 μ l),3 000 rpm离心,取上清,用尿素检测试剂盒(Bioassay公司)对肾脏组织中尿素含量进行检测,检测方法如下:取2.5 μ l肾脏组织上清样本和标准品、2.5 μ l血清样本和标准品分别加到清洁的96孔板中,然后分别加入100 μ l试剂A和试剂B,充分混匀,室温孵育20 min后,用酶标仪检测(520 nm)。计算公式:尿素含量(mg/dL)=(样品吸光度-空白吸光度)/(标准吸光度-空白吸光度)×稀释倍数×50。

1.5数据统计数据用平均值(s)标准差(SD)表示,进行两组比较时,采用 t检验,P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1多囊肾小鼠形态学改变

2.1.1病理改变 多囊肾小鼠早期肾脏大小正常,后期则增大,约为正常的10倍左右,并出现形态异常,如肾盂肾盏的变形,肾乳头及肾锥体的完整结构受到破坏等。一侧肾脏可比另一侧大,同侧肾的囊肿大小发展也不一致,切面可见梭状或柱状囊肿,呈放射状分布,囊肿呈球形,大小不一。初起时肾内可仅有少数囊肿,随病程进展而渐增多,最终肾均被囊肿所占,从皮质到髓质充满大小不等圆形囊肿,囊内均含液体。肾盂和肾盏被膨胀的肾实质压迫而变窄、变小。在光镜下,囊肿间尚可见到完整肾结构,从正常形态到出现肾小球硬化,小管萎缩、间质纤维化等不同表现,这些改变均为囊肿压迫所致肾缺血所为(见图1)。

2.1.2肾脏组织脏器系数的改变 出生后第1、3、6、9、12天,PKD组小鼠肾脏脏器系数与WT组小鼠相比,差异显著,有统计学意义。此外,随着出生后时间延长PKD组肾脏脏器系数逐渐升高,WT组随时间变化不明显(见图2)。

2.2多囊肾小鼠肾脏组织中尿素含量变化

出生后第1、3、6、9、12天,PKD 组小鼠肾脏组织中尿素含量与WT组小鼠相比,差异显著,有统计学意义。此外,随着出生后时间延长PKD组肾脏组织中尿素含量逐渐升高,WT组略升高(见图3)。

图1 出生后不同时间点各组肾脏病理改变(上为WT,下为 PKD)400×

2.3多囊肾小鼠血清中尿素含量

出生后第1、3、6、9、12天,PKD 组小鼠血清中尿素含量与WT小鼠相比,显著升高,差异有统计学意义。PKD组小鼠血清中尿素含量随出生后天数增加略有升高,而WT组小鼠血清中尿素含量随时间变化不明显(见图4)。

图2 出生后不同时间点各组小鼠肾脏器系数

图3 出生后不同时间点各组小鼠肾脏组织尿素含量

图4 出生后不同时间点各组 小鼠血清中尿素含量

3 讨论

多囊肾(polycystic kidney disease)为遗传性疾病,是肾脏一种先天性异常。双侧肾脏皮髓质均可累及,但在程度上可不同。在遗传方式上表现为常染色体显性(ADPKD)和常染色体隐性遗传(ARPKD)两种。90%ADPKD患者的异常基因位于16号染色体的短臂,称为ADPKD1基因,另有10%不到患者的异常基因位于4号染色体的短臂,称为ADPKD2基因[1,2]。常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney,ADPKD)是一种常见的遗传性肾病,发病率约为1/400-1/1 000,约占终末期肾衰病因的10%。ADPKD的主要特征是双侧肾脏形成多个液性囊泡,囊肿进行性长大,造成肾脏结构和功能的损害,最终可引起终末期肾衰。多囊肾病除影响肾脏外,还累及全身多个器官,如颅内动脉瘤、二尖瓣脱垂、肝、胰、脾囊肿、腹壁疝及结肠憩室等,因此,ADPKD也是一种系统性疾病[3-5]。

尿素是蛋白质及氨基酸分解代谢的主要最终产物,也是氨在肝脏中进行解毒的产物,正常人血浆中尿素的浓度约为3.2-7.0 mmol/L,而每日尿中排除的尿素约有10-30克,食入蛋白质越多,尿中排出尿素越多,因此排泄尿素是肾脏的主要功能之一。

多囊肾脏组织特异性敲除小鼠是特异性诱导肾脏PKD1基因发生突变而导致多囊肾发生的动物模型,因此只在肾脏发生囊泡,而其他组织器官不发生囊性变[6]。在国外先进实验室条件下可以存活三周左右,在本试验室可存活两周左右。本实验选取出生后第1、3、6、9、12天五个时间点将PKD 小鼠及野生小鼠处死,分别检测各时间点PKD小鼠及野生小鼠肾脏脏器系数,并应用尿素检测试剂盒对各时间点小鼠肾脏组织、血清中尿素含量进行检测。结果如上,可以看出PKD小鼠肾脏组织脏器系数在各时间点均明显高于野生组,P＜0.05;PKD小鼠肾脏组织及血清中尿素含量在各时间点明显高于WT组,P＜0.05;并随出生时间延长逐渐升高;随出生时间延长,小鼠一般状态越来差,直至死亡。由此可见随多囊肾小鼠出生时间延长、囊泡逐渐增多,肾功能进行性恶化并出现明显肾衰竭临床症状,如进食少,活动量下降等。这和临床观察常人染色体显性遗传多囊肾患者病程进展一致。这提示我们对多囊肾的治疗越早干预,病人长生存率越高,如果能从基因水平加以干预,该病有望得到治愈。

[1]Catherine Boucher and Richard Sandford.Autosomal dominant polycystic kidney disease(ADPKD,MIM 173900,PKD1 and PKD2 genes,proteinproducts known as polycystin-1 and polycystin-2)[J].European Journal of Human Genetics,2004,12:347.

[2]Tamio Yamaguchi,Scott J Hempson,Gail A.Reif,et al.Calcium Restores a Normal Proliferation Phenotype in Human Polycystic Kidney Disease Epithelial Cells[J].Journal of the American Society of Nephrology,2006,17:178.

[3]梅长林,李 林.常染色体显性遗传性多囊肾病分子遗传、发病机制及治疗进展[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2001,10(5):454.

[4]Sayu Omori,Mariko Hida,Hisayo Fujita,et al.Extracellular Signal-Regulated Kinase Inhibition Slows Disease Progression in Mice with Polycystic Kidney Disease[J].Journal of the AmericanSociety of Nephrology,2006,17:1604.

[5]P Hughes,M Robati,W Lu,et al.Loss of PKD1 and loss of Bcl-2 elicit polycystic kidney disease through distinct mechanisms[J].Cell Death and Differentiation,2006,13:1123.

[6]Baoxue Y,ND Sonawane,Dan Z,et al.Small Molecule CFTR Inhibitors Slow Cyst Growth inPKD[J].Journal of the American Society of Nephrology,2008,1:1.