六味五灵片对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用

赵松峰，阚全程

(郑州大学第一附属医院药学部，河南郑州 450052)

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的中间病理阶段，是威胁人类健康的常见疾病，也是原发性肝癌发病的危险因素之一［1］。慢性肝病大多数都有肝纤维化，其中25%～40%最终发展成肝硬化甚至肝癌［2］。六味五灵片(Liuweiwulingpian)由五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉等中药组成，现代药理研究表明，五味子对慢性肝损伤大鼠有保肝降酶作用;女贞子、连翘、苣荬菜有保肝、利湿解毒作用;灵芝孢子粉能增强机体免疫力;莪术清瘀热并可改善肝脏微循环［3］。六味五灵片在治疗慢性肝损伤、乙肝、酒精性肝炎、肝硬化等方面均具有较好的临床疗效［3－5］，但是国内外关于其基础研究未见报道，因此本研究采用四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型，观察六味五灵片对肝纤维化的防治作用，并初步探讨其作用机制，为六味五灵片的临床应用起到了指导性作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物Wistar大鼠(SPF级)，♂，体质量180～220 g，购于郑州大学实验动物中心，在恒温(21～24)℃，相对湿度45% ～50%的环境中适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2试剂CCl4(天津市光复科技发展有限公司，分析纯)，六味五灵片(0.5 g/片，山东世博金都药业有限公司，批号:20101010)，复方鳖甲软肝片(Fufangbiejiaruanganpian，0.5 g/片，内蒙古福瑞中蒙药科技有限公司，批号:20100913)，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)测定试剂盒、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，透明质酸(hexadecenoic acid，HA)酶联免疫分析试剂盒、层粘连蛋白(laminin，LN)酶联免疫分析试剂盒(上海西唐科技有限公司)，羟脯氨酸(hydroxyproline，HyP)酶联免疫分析试剂盒(美国R＆D公司)1.1.3仪器与设备Sartorius BP 211 D型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);SK 5200 HP型超声波清洗机(上海科导超声有限公司);QL-861型漩涡混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);TG16-WS高速离心机(南赛特仪器厂);Therrno 3001 Varioskan Flash全自动多功能酶标仪(北京平利洋医疗设备有限公司);AU-2700型全自动生化分析仪(日本Olympus公司);UV-2409型紫外分光光度计，Olympus BX-50型显微镜，DZKW型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂);DQP-9010石蜡冷冻切片机(上海华岩仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠肝纤维化模型Wistar大鼠90只，体质量180～220 g。随机各选取24只分别作为空白对照组和溶剂对照组，每组12只。空白对照组不做任何处理，自由饮食、饮水;溶剂对照组腹腔注射1 ml·kg－1植物油溶液，每周2次，共4周;其余大鼠均腹腔注射1 ml·kg－140%的CCl4－植物油溶液，每周2次，共4周，构建肝纤维化模型。建立大鼠肝纤维化模型过程中，死亡4只，于末次注射后禁食不禁水20 h，眼静脉丛取血，检测血清中ALT、AST含量，60只大鼠血清中ALT、AST与空白对照组对比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。表明60只大鼠肝纤维化模型复制成功。见Tab 1。

Tab 1 Serum ALT and AST in hepatic fibrosis rats(±s)

Tab 1 Serum ALT and AST in hepatic fibrosis rats(±s)

#P＜0.05 vs control group

Group ALT/IU·L－1 AST/IU·L －1 Control 46.32 ±10.23 48.29 ±9.88 Solvent 47.98 ±7.89 52.23 ±6.79 Model 253.81 ±59.07# 238.12 ±68.12#

1.2.2动物分组及处理将复制CCl4肝纤维化模型而存活的60只大鼠，随机分为5组，每组12只，分别为模型组、阳性对照药复方鳖甲软肝片组(750 mg·kg－1)、六味五灵片低剂量组(4 g·kg－1)、六味五灵片中剂量组(8 g·kg－1)、六味五灵片高剂量组(16 g·kg－1)。除空白对照组和溶剂对照组外，其余各组继续腹腔注射1 ml·kg－140%的CCl4－植物油溶液，每周两次。复方鳖甲软肝片组及六味五灵片低剂量、中剂量、高剂量组每天1次灌胃给药，共4周。所有大鼠在整个实验期间均喂标准食料，自由饮水。

1.2.3主要观察指标于末次灌胃后禁食20 h，眼静脉丛取血后断颈处死，取血清于－20℃保存，用于测定AST、ALT、HA、LN及HyP。另取肝脏右叶于体积分数10%的甲醛溶液中固定，用于病理切片Masson染色的分析，其余肝脏于液氮中保存，进行生化指标GSH、SOD及MDA含量的测定。所有指标测定均按试剂盒操作。

1.2.4统计学处理采用统计学软件SPSS 13.0进行统计学分析，计量资料用±s表示，比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1六味五灵片对大鼠血清中AST、ALT的影响

溶剂对照组血清中AST、ALT与空白对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。模型组血清中AST、ALT较空白对照组高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比，六味五灵片低剂量组大鼠血清中AST和ALT降低，但差异均无统计学意义(P＞0.05);六味五灵片中、高剂量组大鼠血清中AST和ALT降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。这提示中剂量和高剂量六味五灵片均可明显降低由CCl4造成的大鼠血清中AST和ALT的升高。见Tab 2。

Tab 2 Effect of Liuweiwuling on serum ALT and AST in rats(±s，n=12)

Tab 2 Effect of Liuweiwuling on serum ALT and AST in rats(±s，n=12)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs model

Group Dose/g·kg－1 ALT/IU·L－1 AST/IU·L －1 Control － 47.23 ±21.32 45.39 ±3.98 Solvent － 52.24 ±17.81 55.54 ±7.99 Model － 248.71 ±46.42# 209.93 ±18.16#Fufangbiejiaruanganpian 0.75 92.49 ±30.73* 89.33 ±19.51*Low dose liuweiwulingpian 4 190.66 ±43.77 185.36 ±9.74 Middle dose liuweiwulingpian 8 125.73 ±25.30* 141.61 ±6.72*High dose liuweiwulingpian 16 99.76 ±13.64* 97.37 ±6.67*

2.2六味五灵片对大鼠血清HA、LN和Hyp的影响溶剂组大鼠血清HA，LN和HyP含量与空白对照组对比差异均无统计学意义(P＞0.05);模型组大鼠血清HA，LN和HyP含量与空白组对比差异有显著性(P＜0.05);与模型组相比，六味五灵片中、高剂量组差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果提示，中剂量和高剂量六味五灵片能够明显降低由CCl4造成的大鼠血清HA，LN和HyP含量升高。见Tab 3。

Tab 3 Effect of Liuweiwuling on serum HA，LN and HyP in rats(±s，n=12)

Tab 3 Effect of Liuweiwuling on serum HA，LN and HyP in rats(±s，n=12)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs model

Group Dose/g·kg－1 HA/μg·L－1 LN/μg·L－1 HyP/μg·L －1 Control － 149.46 ±21.62 85.39 ±3.98 16.38 ±0.30 Solvent － 151.24 ±37.81 85.54 ±3.99 16.78 ±0.48 Model － 368.71 ±38.42# 127.93 ±18.16# 23.13 ±0.58#Fufangbiejiaruanganpian 0.75 292.49 ±33.45* 89.75 ±9.51* 18.84 ±0.90*Low dose liuweiwulingpian 4 342.74 ±52.73 125.32 ±19.24 22.14 ±0.16 Middle dose liuweiwulingpian 8 269.32 ±35.43* 101.43 ±16.24* 19.98 ±0.38*High dose liuweiwulingpian 16 199.75 ±31.56* 93.37 ±12.33* 18.46 ±0.97*

Tab 4 Effect of Liuweiwuling on GSH，MDA and SOD in rats(±s，n=12)

Tab 4 Effect of Liuweiwuling on GSH，MDA and SOD in rats(±s，n=12)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs model

Group Dose/g·kg－1 GSH/mg·g－1Pro MDA/nmol·g－1Pro SOD/U·g－1Pro Control － 3.01 ±0.24 1.43 ±0.32 278.54 ±28.70 Solvent － 2.92 ±0.46 1.32 ±0.35 272.08 ±19.73 Model － 1.87 ±0.26# 3.00 ±0.45# 165.75 ±12.65#Fufangbiejiaruanganpian 0.75 2.66 ±0.47* 2.37 ±0.52* 157.65 ±17.44 Low dose liuweiwulingpian 4 1.96 ±0.57 2.73 ±0.43 170.85 ±25.37 Middle dose liuweiwulingpian 8 2.14 ±0.23* 2.13 ±0.28* 211.31 ±39.41*High dose liuweiwulingpian 16 2.52 ±0.42* 1.69 ±0.70* 241.21 ±38.40*

Fig 1 The Masson trichrome examinations of the liver sections in rats(×200)

2.3六味五灵片对肝纤维化大鼠肝组织中GSH、MDA和SOD的影响溶剂对照组大鼠肝组织中GSH、MDA和SOD的含量与空白对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);与空白对照组相比，模型组大鼠肝组织中GSH和SOD降低，MDA升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比，六味五灵片中、高剂量组大鼠血清GSH和SOD含量升高，而 MDA降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见Tab 4。

2.4六味五灵片对肝纤维化大鼠组织病变的影响

Masson染色结果显示，空白对照组肝组织染色显示小叶间和汇管区基本无胶原纤维分布，中央静脉及肝窦内有轻微的胶原纤维分布，在偏光显微镜下基本不见红黄及绿色的胶原纤维，肝小叶结构正常，未见纤维增生。模型组Masson染色下可见汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，肝小叶被重新分割，组织切片中有大量假小叶形成，胶原纤维呈宽带状，互相连接，细胞变性坏死明显。偏光显微镜下区分可见红、黄色成分居多。六味五灵片高剂量组肝组织胶原纤维明显减少，肝小叶结构也有所恢复，仍有部分点状细胞坏死。六味五灵片中剂量组肝组织胶原纤维明显减少，肝小叶结构也有所恢复，细胞坏死明显。

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同途径。肝纤维化的实质是由于胶原和其它细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致ECM在肝内过量沉积。参与肝纤维化形成的ECM成分包括胶原蛋白、非胶原性糖蛋白和蛋白多糖3大类［6］。HA是构成ECM中蛋白多糖的主要成分，LN是一种重要的结构糖蛋白，HA和LN对慢性肝损伤和肝纤维化的诊断价值已得到普遍承认［7］。胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，HyP为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。其对肝纤维化的发生和发展起重要作用［8－9］。

在慢性炎症、机化和瘢痕形成中，可随病理过程的发展而出现胶原纤维。在早期，HE染色切片中的这些纤维往往和纤维蛋白很难鉴别，通过胶原纤维染色则可证实，因此本实验采用Masson染色观察肝组织的纤维化病变。

本研究表明，六味五灵片可以明显降低由CCl4所致的大鼠血清中AST、ALT的升高，说明六味五灵片具有抑制肝损伤的作用;六味五灵片还可以降低血清中升高的HA、LN和HyP含量。Masson染色提示其可以抑制纤维增生，说明六味五灵片可以抑制肝脏胶原纤维的合成和沉积，具有抗肝纤维化作用;此外，六味五灵片还可明显升高损伤肝组织的GSH和SOD含量，降低MDA的含量，说明六味五灵片具有抗氧化作用，这些作用可能与六味五灵片抗肝纤维化机制有关。六味五灵片的具体临床疗效还需要更多的实验进行进一步验证。

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