左旋精氨酸通过上调Th1应答介导抗疟保护性免疫

潘艳艳，刘 军，李 莹，延 娟，冯永辉，王各各，冯 辉，郑 丽，曹雅明

(中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳 110001)

疟疾是由疟原虫感染引起的严重威胁人类生命的感染性疾病之一。最新的统计显示，全世界每年有2～3亿疟疾感染病例，病死人数高达100万［1］。

L-Arg能够发挥抗肿瘤、促进伤口愈合和增强机体细胞免疫和体液免疫应答等多种功能［2－3］。尤其是L-Arg的免疫增强作用已备受关注。有限的研究表明疟疾感染患者L-Arg水平明显降低［4］，L-Arg能够恢复印度尼西亚患有严重疟疾的成人内皮功能以及促进NO的产生［5］。IFN-γ直接或间接抑制疟原虫肝内期的发育是L-Arg依赖的［6］。然而，目前关于L-Arg在疟疾感染免疫中对Th1免疫应答的作用尚不清楚。

本研究利用我们成功建立的P.y17XL易感鼠疟模型，观察了L-Arg对P.y17XL易感鼠的Th1免疫应答影响，以期探讨L-Arg在P.y17XL感染中的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、疟原虫及主要试剂6～8周龄、♀BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证编号:SCXK京200420001);P.y17XL(日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠);抗体均购自BD或eBioscience公司;L-Arg购自 Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。

1.2实验动物感染BALB/c小鼠分别经腹腔感染1×106P.y17XL寄生的红细胞(pRBC)，感染不同时间小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率，并每日观察生存率。

1.3动物分组与L-Arg处理BALB/c小鼠随机分为2组:生理盐水处理组(NC组)、感染前7天LArg处理组(L-Arg组)。每组20只小鼠。1.5 g·kg－1体质量口服生理盐水或L-Arg。

1.4脾细胞培养小鼠感染0、3和5 d无菌摘取脾脏，常规制备脾细胞悬液，以台盼蓝液检查脾细胞活性，确定活细胞超过90%。用含10%FCS的RPMI1640调整脾细胞终浓度至每毫升1×107个，24孔培养板(FALCON)，每孔加入500 μl细胞悬液，1式3孔，培养48 h。350×g室温离心10 min，收集上清，－80℃保存，待测细胞因子及NO。

1.5细胞因子及NO检测双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清IFN-γ的含量分别进行检测，酶标仪(Inter MedNJ-2100)测定450 nm处OD值。绘制标准曲线，计算细胞因子含量(ng·g－1)。Griess试剂检测脾细胞培养上清中NO含量，100 μl细胞培养上清液和100 μl Griess反应液室温反应10 min，酶标仪检测550 nm处OD值，以NaNO2作为标准品进行浓度换算。

1.6流式细胞仪检测小鼠脾脏CD4+CD69+T细胞、F4/80+CD36+巨噬细胞。每份样品用抗－CD4-FITC单抗和抗－CD69-PE单抗进行双色分析。脾细胞悬液中加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体，再加入抗－F4/80－FITC单抗和抗－CD36－PE单抗进行表面染色。离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。

1.7统计学分析使用SPSS统计软件对数据进行处理，采用独立样本t检验对数据做统计分析。

2 结果

2.1小鼠感染不同时间原虫血症及其生存率如Fig 1所示，NC组小鼠感染后3 d原虫血症水平开始迅速上升，小鼠于感染后d 6～8全部死亡。与此相比，L-Arg组小鼠原虫血症上升缓慢，在感染d 16小鼠全部死亡。

2.2小鼠感染不同时间CD4+CD69+T细胞和F4/80+CD36+巨噬细胞数量如Fig 2所示，与NC组相比，L-Arg组小鼠于感染后 d 3和 d 5 CD4+CD69+T细胞和F4/80+CD36+巨噬细胞数量均出现升高(P＜0.05)。

2.3小鼠感染不同时间脾细胞培养上清中IFN-γ和NO水平如Fig 3所示，L-Arg组小鼠于感染后d 3和d 5 IFN-γ和NO水平均比NC组小鼠高(P＜0.05)。

3 讨论

在红内期保护性免疫应答中，CD4+T细胞发挥至关重要的作用，疟原虫感染早期宿主建立的以IFN-γ分泌增加为主的Th1型细胞免疫应答是抑制红内期疟原虫增殖的关键效应机制［7］。我们发现，L-Arg明显促进了Th1免疫应答的建立，原虫血症水平得到控制、生存期延长。同时，我们还发现LArg组小鼠F4/80+CD36+细胞数量出现有意义的升高。CD36是清道夫受体家族B型受体，目前认为CD36在介导巨噬细胞非调理性吞噬功能中发挥重要作用［8］。研究表明CD36缺陷个体发生严重疟疾的危险性要明显升高［9］。巨噬细胞是非特异性免疫效应分子NO的重要来源，NO氧化后形成的过氧化氮是巨噬细胞发挥杀伤毒性的主要效应分子［10］，我们发现脾细胞培养上清中NO产生也出现明显升高。

Fig 1 The parasitemia(A)and survival rate(B)in different time after infection

Fig 2 Absolute numbers of CD4+CD69+cells(A)and F4/80+CD36+cells(B)in splenocytes in different time after infection

Fig 3 Level of in IFN-γ(A)and NO(B)in splenocyte supernatants in different time after infection

综上，L-Arg能够有效地增强易感的BALB/c小鼠感染早期Th1型细胞免疫应答的建立，对于研制抗疟新药将具有重要的科学意义。

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