黄芪多糖体外抗CVB3病毒活性

郑兰兵 魏 青 刘小玲 刘小雷*

（1 内蒙古自治区第三医院，内蒙古 呼和浩特 010010；2 内蒙古医学院第一附属医院，内蒙古 呼和浩特 010059；3 内蒙古自治区医院，内蒙古 呼和浩特 010018；4.内蒙古医学院药学院，内蒙古 呼和浩特 010059）

病毒感染是病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）最常见的病因，近年来，发病率有逐渐增多的趋势，有多种可病毒引起VMC，其中以柯萨奇B组3型病毒（Coxsackie virus，CVB3）最为常见[1]。许多文献报道中药具有明显的心肌细胞保护和抑制病毒增殖作用，黄芪就是其中最重要的一种。现研究发现黄芪中小分子化合物如黄芪甲苷、黄酮类具有肯定的抗病毒作用外，较大的分子化合物，黄芪多糖（ASP）也具有提高免疫保护心肌细胞的生物活性[2]。本文利用已经建立的病毒性心肌炎细胞模型，观察黄芪多糖对心肌细胞的保护作用，并试图探讨其心肌保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物、病毒及细胞株

黄芪多糖（ASP），从蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，黄芪多糖ASP（Astragalus Sachalinensis Polysaccaride），由中国科学院兰州化学与物理研究所汪道全教授提供，质量分数95.6%；Wistar新生乳鼠心肌细胞，购自内蒙古大学动物中心，生产许可证：SCXK（蒙）2002-0001；VERO细胞：由中国军事医学科学院五所惠赠；CVB3病毒：中国科学院昆明病毒所提供。

1.1.2 主要试剂

免疫组织化学试剂盒（中山生物技术公司，SA102）；凋亡检测试剂盒（宝赛生物技术公司，CX101-3）；心肌细胞anti-α-actin（中山生物技术公司，3111003）；盐酸胍（华美生物工程公司，BR136）；CK-MB试剂盒（华美生物工程公司，03104）；LDH试剂盒（华美生物工程公司，031020）。

1.1.3 主要仪器

CO2孵箱：日本三洋株式会社；酶标仪（Model550）：美国Bid-Rad公司；低温离心机（RC SC）：美国Sorvall公司；高速冷冻离心机（Z360K）：德国Hermle公司；微量移液器：德国EPPENDORF公司；生物倒置显微镜：日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 在VERO细胞上抗CVB3病毒实验[3]

试验方法参照文献[3]。

1.2.2 在原代心肌细胞上抗CVB3病毒实验[3]

试验方法参照文献[3]。

1.2.3 病毒繁殖抑制实验[3]

试验方法参照文献[3]。

1.2.4 原代心肌细胞培养液心肌酶活性测定

1.2.4.1 LDH的测定

试验方法参照文献[4]。

1.2.4.2 CK-MB的测定

试验方法参照文献[4]。

2 结 果

2.1 ASP在VERO细胞上抗CVB3作用

VERO细胞试验结果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL浓度下，能抑制CVB3病毒对VERO细胞破坏作用，与阴性对照组（病毒）比较，OD值有显著性差异，并呈效应与浓度依赖的关系（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 ASP抗CVB3病毒作用结果（VERO细胞）（±s，n=8）

表1 ASP抗CVB3病毒作用结果（VERO细胞）（±s，n=8）

注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01

组别 剂量（μg/mL） OD值细胞对照组 — 0.9493±0.1321病毒对照组 250TCID50 0.5801±0.1299bb病毒＋盐酸胍组 31.3 0.6251±0.1567 62.5 0.8130±0.0869a 125.0 0.8275±0.0876a病毒+ASP组 7.8 0.5823±0.2292 15.6 0.6781±0.1424 31.3 0.7758±0.2305a 62.5 0.8058±0.1249a 125.0 0.9848±0.3392aa

2.2 ASP在新生乳鼠心肌细胞上对CVB3的作用

Wistar新生乳鼠心肌细胞CVB3感染48h后，心肌细胞出现萎缩、变形及脱落，感染后72h至第5天心肌细胞搏动减弱甚至停止，CPE增多。从表2数据可看出，病毒+ASP组（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌细胞形态正常、搏动有力。MTT染色数据表明：给药各浓度组与阴性对照组比较，乳鼠心肌细胞存活率明显增高，各ASP组与阴性对照组比较，OD值有显著性差异（P＜0.01），见表2。

表2 ASP抗CVB3病毒作用结果（原代心肌细胞）（±s，n=8）

表2 ASP抗CVB3病毒作用结果（原代心肌细胞）（±s，n=8）

注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01

组别 剂量（μg/mL） OD值细胞对照组 — 0.8028±0.1685病毒对照组 250TCID50 0.4088±0.0847bb病毒+盐酸胍组 15.6 0.4203±0.0952 31.3 0.5985±0.1117aa 62.5 0.6323±0.1248aa病毒+ASP组 3.9 0.4532±0.0837 7.8 0.4564±0.0799 15.6 0.6409±0.1965aa 31.3 0.6439±0.0827aa 62.5 0.6594±0.2543aa

2.3 病毒繁殖抑制试验影响

根据表3试验数据，ASP给药组在31.3μg/mL剂量下，已造成病毒繁殖抑制作用，125.0μg/mL浓度时与盐酸胍对照组抑制作用一致，且有药物浓度相关性。

表3 ASP对病毒繁殖抑制影响（VERO细胞）

2.4 对Wistar新生乳鼠心肌细胞LDH测定结果

从表4数据看到：ASP对Wistar新生乳鼠心肌细胞培养液中LDH活性影响，仅在高剂量下（62.5μg/mL）降低其酶活性（P＜0.05）。

２.5 对乳鼠心肌细胞培养液CK-MB测定结果

表4 ASP对原代心肌细胞上清培养液LDH活性影响（±s，n=8）

表4 ASP对原代心肌细胞上清培养液LDH活性影响（±s，n=8）

注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01 ；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01

组别 剂量（μg/mL） 酶活力单位细胞对照组 — 6233.0±1024.0病毒对照组 250TCID50 8346.5±1875.0bb病毒+盐酸胍组 15.6 6918.8±1028.5 31.3 6633.0±1326.1 62.5 6524.0±1423.5a病毒+ASP组 3.9 8308.8±1399.1 7.8 7730.5±1870.8 15.6 7663.5±1221.7 31.3 7015.0±1547.4 62.5 6595.0±1192.6a

从表5数据看到：ASP在31.3、62.5μg/mL浓度下可降低Wistar新生乳鼠心肌细胞培养液CK-MB酶活性，有药物浓度相关性（P＜0.05、P＜0.01）。

表5 ASP对培养大鼠心肌细胞CK-MB活性的影响（加病毒48小时后）（±s）

表5 ASP对培养大鼠心肌细胞CK-MB活性的影响（加病毒48小时后）（±s）

注：与病毒对照比较：aP＜0.05，aaP＜0.01；与细胞对照比较：bP＜0.05，bbP＜0.01

组别 样本数 剂量（μg/mL） 酶活力单位细胞对照组 8 — 68.9±18.5病毒对照组 7 250TCID50 152.4±34.8bb病毒+盐酸胍组 8 15.6 116.2±31.8 8 62.5 75.1±20.5aa病毒+ASP组 6 3.9 126.0±10.8 8 31.3 113.7±25.91 8 7.8 113.5±23.9 8 15.6 112.5±35.9 8 31.3 99.5±19.1a 8 62.5 78.3±15.7aa

3 讨 论

本文使用从蒙古黄芪中分离纯化的黄白色粉末状多糖，经测定为a-糖苷键连接，相对分子质量约35000，水解多糖检出半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖及葡萄糖等。含有糖醛酸为葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，为水溶性酸性杂多糖。

CVB3病毒接种于VERO细胞时，可看到VERO细胞发生病变，表现为细胞萎缩、胞质颗粒化、折光度增强、与周边细胞原有的紧密接触渐渐消失，最后细胞变形破裂而从培养皿上脱落[5]。鉴于VERO细胞对CVB3病毒敏感这一特点，本文以VERO细胞为敏感细胞株，采用MTT染色法，研究了ASP在VERO细胞上的抗CVB3病毒作用。MTT染色结果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL浓度下，能抑制CVB3病毒对VERO细胞的损伤，与阴性对照组比较，OD值有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），并呈效应与浓度依赖的关系。其作用可能是通过竞争抑制方式阻止CVB3病毒与VERO细胞结合，阻碍病毒的吸附而影响病毒的复制。

新生乳鼠心肌细胞在感染CVB3病毒后2～5d可出现明显细胞病变，早期可直接损害心肌细胞，不仅能关闭细胞核酸及蛋白质的合成，且其蛋白酶A2能裂解心肌细胞中dystrophin蛋白，打乱心肌细胞骨架结构。后期可引起心肌细胞Ca2+内流增加，胞内Ca2+浓度超负荷从而导致心肌细胞变形、脱落、损伤、破裂及诱导心肌细胞凋亡[6]。由于心肌细胞的破裂其胞内乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸激酸激酶（CKMB）释放明显增高。因此本文采用心肌细胞为敏感细胞株，观察给予ASP后CVB3病毒对心肌细胞形态（MTT染色）及搏动影响，测定培养液中LDH及CK-MB的活性。从试验数据可以看到，病毒+ASP组（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌细胞与病毒对照组比较，细胞形态正常、搏动有力，MTT染色数据表明：给药各浓度组与阴性对照组比较，乳鼠心肌细胞存活率明显增高，OD值有显著性差异（P＜0.01）。ASP在高剂量下（62.5μg/mL）降低乳鼠心肌细胞培养液中LDH酶活性（P＜0.05），同样在31.3μg/mL、62.5μg/mL浓度下可降低CK-MB酶活性，且有药物浓度相关性（P＜0.05、P＜0.01）。而病毒繁殖抑制的结果也表明，ASP可抑制CVB3病毒在VERO细胞内的复制。

本文仅观察了ASP体外细胞水平上抗CVB3病毒活性，测定ASP在CVB3病毒的攻击下对VERO和乳鼠心肌细胞的保护及对CVB3病毒的抑制。ASP的作用机制和对VMC临床治疗效果，尚需进行整体动物实验进一步探讨。

[1] 孙成文,周国赣,江岩,等.黄芪多糖抗氧化损伤作用的研究[J].中国药理学通报,1996,12(2):161.

[2] 单俊杰,王顺春,刘涤,等.黄芪多糖的化学和药理研究进展[J].上海中医药大学学报,2000,14(3):61-64.

[3] 刘小玲,张勇,刘小雷.苦参系列生物碱体外抗CVB3病毒活性[J].沈阳药科大学学报,2006,23(11):724-730.

[4] 刘小玲,张勇,刘小雷.广枣总黄酮体外抗CVB3病毒活性[J].中国医院药学杂志,2007,27(12):1-5.

[5] 刘小雷,张宪武,于东升.病毒性心肌炎细胞调亡机制的探讨[J].内蒙古医学杂志,2005,6(37):92-97.

[6] 刘晓雷,宿瑞俊,贾秀珍,等.黄芪多糖体外抗病毒性心肌炎试验研究[J].中国分子心脏病学杂志,2003,9(2):79.