结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

孙凤丹 李月龙 韩忠波

异烟肼(INH)作为最主要的一线抗结核药物之一，对其耐药性的研究日益受到重视。国外也有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，与inhA基因突变也有相关性［1］。我们采用采用PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法检测了95株肺结核患者痰标本临床分离株，并对47例结核患者痰标本直接进行KatG基因、inhA基因突变检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 95株结核分枝杆菌临床分离株和47例肺结核患者涂阳痰标本。95株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中51株对异烟肼耐药，44例对异烟肼敏感。47例肺结核患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中18例对异烟肼耐药，29例对异烟肼敏感。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用传统酚/氯仿抽提法提取标本中 DNA［2］。

1.2.2 PCR扩增 采用25ul反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mm01/l，引物终浓度为0.2 umol/L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸 l min，循环 30 次，最后 72℃延伸l0 min。扩增产物扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带、rpsL出现267bp条带即为扩增阳性。

1.2.3 SSCP银染 PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10 min，立即冰浴5 min，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃100 V电压，电泳约2～3 h，电泳结束后.，取凝胶板经硝酸银染色，观察结果并照相。

2 结果

2.1 PCR扩增，以结核分支杆菌H37RV为对照，44株药物敏感株、51株耐INH分离株KatG、inhA基因扩增均为阳性;47例耐INH肺结核患者痰标本中，KatG基因44例扩增阳性、inhA基因40例扩增阳性(见表1)。

2.2 应用PCR-SSCP技术检测KatG、inhA基因突变结果(见表1、2)。44株药物敏感株的KatG、inhA基因突变率分别为4.5%、0。51株耐INH分离株中，31株KatG基因发生突变，突变率为60.8%;3株inhA基因发生突变，突变率为5.9%。耐INH肺结核患者痰标本中，基因突变检测率分别为47.7%、7.5%。

表1 对47例肺结核患者痰标本的检测结果

表2 对95例临床分离株的检测结果

3 讨论

近年来，耐药结核病病情逐年上升，特别是对异烟肼和利福平耐药的耐多药结核病(MDR-TB)的增多，是影响结核病化疗效果的主要原因。因此，建立一种新的快速，有效的药敏试验方法对结核病的早期治疗具有重要的意义。有研究表明［3］结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，与inhA基因也有相关性。本实验PCR-SSCP方法得出耐异烟肼时，KatG基因突变率为60.8%、inhA基因突变率为5.9%。表明KatG基因突变是结核分支杆菌耐异烟肼临床分离株主要的基因突变类型。说明KatG在INH耐药中起主导作用，但某些菌株的耐INH形成可能与KatG无关。KatG基因突变是INH耐药性的重要分子机制，inhA基因与INH耐药性有相关性。

由于有90-95%的耐利福平株同时也耐INH，这样单独进行INH的药物敏感性分析可初步制定细菌的耐药谱。同时检测了47例耐INH肺结核患者的痰标本，44例扩增阳性的耐INH痰本KatG基因突变率为47.7%、inhA基因突变率为7.5%，说明应用PCR和PCT-SSCP技术可以简便、快速直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌KatG基因突变，为临床检测结核分支杆菌耐异烟肼的耐药性提供了初步依据。

［1］ Pretorius QS，Van Helden PD，Strge1 F，et al.Matation in Katg gene，Antimicrob，Agents Chenother，1995，39(10):2276.

［2］ 张小刚，何秀云，等.结核分支杆菌耐链霉素耐药基因的检测.实用医学杂志，2001，17(10):1006-1007.

［3］ 张宗德，马与，程绍基，等.异烟肼耐药与结核分支杆菌KatG基因突变的研究.中华结核和呼吸杂志，1996，19(6):346-349.