苏木素在真菌性角膜炎诊断中的应用

吴胜哥

真菌性角膜炎是我国常见的致盲眼病。近年来，真菌性角膜炎发病率不断上升，部分地区成为首位感染性眼病［1-3］。真菌性角膜炎的确诊一般依靠涂片细胞学和真菌培养为主［4］。真菌培养是真菌性角膜炎诊断的“金标准”［4-5］，但真菌培养时间长，等待结果往往延误治疗［5］。传统KOH湿片法检查真菌性角膜炎的诊断阳性率低，误诊率高。如何快速准确地诊断真菌性角膜病是目前研究的热点［4］。本研究收集2006年6月至2011年6月期间临床诊断为真菌性角膜炎病例59例，研究苏木素在真菌性角膜炎早期诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 我院2006年6月至2011年6月期间临床诊断为真菌性角膜炎病例，59例患者中男36例，女23例;右眼31例，左眼28例;年龄15～67岁，平均49.3岁;农民38例，工人13例，其他8例;眼外伤史51例，引起外伤的异物为植物性(谷物、草、木头、竹子、树叶等)31例，土壤14例，焊屑9例，其他5例;3例既往有使用糖皮质激素、免疫抑制剂病史。

1.2 方法

1.2.1 角膜刮片操作方法 倍诺喜表面麻醉，75%酒精消毒眼周皮肤，开睑器开睑，用消毒手术刀刮取角膜溃疡表面、周边部及基底部物质，标本涂片行苏木素染色和KOH湿片法查找真菌，并行真菌培养。

1.2.2 KOH湿片法查找真菌 取适量角膜溃疡刮取物涂片于载玻片上，尽量将刮取物薄层铺开，滴加10%氢氧化钾1滴，盖上盖玻片，放置10 min，使杂质溶解，显微镜下先用低倍镜找到标本位置，再用高倍镜查找菌丝和孢子。

1.2.3 苏木素染色查找真菌 取适量角膜溃疡刮取物涂片于载玻片上，滴加苏木素20 μl，尽量将刮取物薄层铺开，盖上盖玻片，放置5 min染色，显微镜下先用低倍镜找到标本位置，再用高倍镜查找菌丝和孢子。

1.2.4 真菌培养 取适量角膜溃疡刮取物接种于沙氏培养基试管，斜面朝上，25℃温箱孵育培养3～21 d，观察有无真菌生长，根据菌落的外观、生长速度、菌丝、孢子或菌细胞形态特征等进行菌种鉴定。

1.3 数据收集及统计学处理 以真菌培养结果作为确诊真菌性角膜炎的“金标准”。计算苏木素染色法和KOH湿片法查找真菌的阳性率、灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率、正确指数、阳性预测值和阴性预测值。

2 结果

KOH湿片法真菌菌丝显示为近透明条索状结构，与背景对比度差(图1-A)。苏木素染色后真菌菌丝显示为蓝色管腔状结构，与背景对比度强(图1-B)。59例真菌性角膜炎病例中47例检出真菌，阳性率79.66%。苏木素染色法查找真菌阳性率64.40%，灵敏度74.46%，特异度42.86%，假阳性率25.00%，假阴性率25.53%，正确指数17.32%，阳性预测值92.11%，阴性预测值42.85%。KOH湿片法查找真菌阳性率45.76%，灵敏度 44.68%，特异度 18.75%，假阳性率50.00%，假阴性率55.32%，正确指数-36.57%，阳性预测值77.78%，阴性预测值18.75%。

图1 涂片查找真菌(100，A:KOH湿片法，B:苏木素染色法)

3 讨论

真菌性角膜炎是严重的致盲眼病，早期诊断、早期治疗对视力预后有决定性的影响。真菌性角膜炎的确诊需依靠实验室检查［4］。本研究发现苏木素染色法查找真菌的灵敏度、特异度、阳性率、正确指数、阳性预测值、阴性预测值均高于KOH湿片法;苏木素染色法查找真菌的假阳性率、假阴性率均低于KOH湿片法。诊断试验的真实性包括灵敏度和特异度。灵敏度即真阳性率，指的是诊断试验能将实际患病的病例正确地判断为患病的能力。特异度即真阴性率，是指诊断试验能将实际未患某病的病例正确地判断为未患病的能力。正确指数(约登指数)=灵敏度+特异度-1。灵敏度、特异度越高，诊断试验的正确指数愈高，则该试验的真实性愈高。本研究发现苏木素染色法查找真菌的灵敏度、特异度和正确指数均高于KOH湿片法查找真菌，这说明苏木素染色法查找真菌的真实性更高。阳性预测值是指诊断试验阳性的病例中真阳性的比例;阴性预测值是指试验阴性的病例中真阴性的比例。研究人群患病率水平对诊断试验阳性预测值的影响却很大。本研究人群为临床诊断真菌性角膜炎病例，这属高危人群，诊断试验的阳性预测值较高。本研究发现苏木素染色法查找真菌的阳性预测值高于KOH湿片法查找真菌，达92.11%。这说明苏木素染色法查找真菌阳性的病例患真菌性角膜炎的可能性很大，这可用于指导临床早期治疗。假阳性率指诊断试验将实际未患病的病例错误判断为患病的能力，即为误诊率。假阴性率是指诊断试验将实际患病的病例错误判断为无病的能力，即为漏诊率。本研究发现苏木素染色法查找真菌的假阳性率、假阴性率均低于KOH湿片法查找真菌。这说明苏木素染色法查找真菌的误诊率和漏诊率均较低。

苏木素是临床病理最常用的染色剂之一，价格便宜，易于获得。苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，能够在使细胞核染色。苏木素为紫色液体，可将菌丝、孢子染色紫色，增强与背景的对比度，使菌丝和孢子易于被检出，从而提高了诊断试验的灵敏度、阳性率、阳性预测值;且染色后的菌丝与角膜纤维、杂质易于区分，提高了诊断试验的特异生、阴性预测值。

影响真菌涂片检出率的因素。①苏木素染液苏木素染液久置后会产生沉淀，过滤后染色，这可减少由于染液沉淀造成假阳性的出现，减低误诊率。②标本采集当刮片中真菌数量少时，苏木素染色检出率就下降［4-5］。由于真菌生长多位于溃疡周边部及底部，但溃疡中央的白色粘性物质往往是菌丝丛，角膜标本少，采集的标本时连溃疡中央的白色粘性物质一起采聚后直接涂片可提高真菌涂片的检出率。③涂片过厚涂片过厚时，标本重叠不利于镜下观察判断，涂片标本应在染色液中尽量分散开，必要时在盖玻片上加压促进团块状物质分散。

随着角膜接触镜的普及以及广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛使用，真菌性角膜炎的发病率不断增高。真菌性角膜炎早期、快速、有效的诊断方法是目前研究的热点［1，2，4］。激光共焦显微镜和PCR技术在真菌性角膜炎诊断领域中展示了良好的应用前景，但其价格昂贵，目前还不能普及应用［6-8］，且有许多问题有待进一步研究。苏木素染色法价格便宜，查找真菌几分钟便可出结果，灵敏度高，阳性预测值高，是真菌性角膜炎早期诊断简单、快速、有效的方法。

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