广西某牛场死亡病例的病理学观察及病原菌的分离鉴定*

廖素环,韦英益,邓丽娟,黄伟坚

(广西大学动物科学与技术学院,广西南宁 530005)

广西某牛场死亡病例的病理学观察及病原菌的分离鉴定*

廖素环,韦英益*,邓丽娟,黄伟坚

(广西大学动物科学与技术学院,广西南宁 530005)

2010年7月某养牛场肉牛开始发病,临床症状表现为食欲下降,流鼻,体温升高,呼吸困难等,病程7 d至1月,病牛因极度虚弱而死亡。为查明病因并制定有效的综合防控措施,对其中5头病死牛肺和脾等内脏器官进行病理学观察、细菌分离鉴定以及药敏试验。病理组织学观察显示,肺表现为纤维素性大叶性肺炎病变,肺细支气管、肺泡腔内有大量中性粒细胞、纤维素以及少量的淋巴细胞、单核细胞浸润,肺泡壁毛细血管扩张充血;脾脏的脾小体减少甚至消失,红髓区严重出血,中性粒细胞浸润。从剖检的5头病死牛肺、心、脾脏中均分离到金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、牛链球菌和溶血性巴氏杆菌等4种病原菌。药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌对各类药物均高度敏感,肺炎链球菌和牛链球菌对青霉素类、头孢类和四环素类药高度敏感,溶血性巴氏杆菌对头孢噻肟、头孢哌酮和强力霉素高度敏感。综合病理变化以及病原菌的分离鉴定结果,表明因多重病原菌感染而引发牛严重的呼吸道疾病。

牛呼吸道感染;病原菌;分离;组织病理学变化

*通讯作者

牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是由多种病原体相互作用引起的牛肺炎、运输热、支气管炎等疾病的通称,可发生于犊牛、育肥肉牛和奶牛,常于早期断奶、长途运输和天气寒冷等应激条件下,激发潜在病毒感染造成机体上呼吸道黏膜损伤,继发细菌感染,从而导致疾病的发生[1-2]。临床表现为高热、眼鼻分泌物增多、咳嗽、呼吸困难、精神沉郁等[3]。组织病理学观察表现纤维蛋白性胸膜炎、急性或亚急性的间质性肺炎、化脓性支气管肺炎和出血[4]。据报道在牛呼吸道疾病综合征中分离出的病毒有牛疱疹病毒(BHV-1)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、副流感病毒(PI3)、新生牛腹泻冠状病毒(BCV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛呼肠病毒(BRV)[5]。病毒感染激发了细菌的继发感染,常分离到嗜血杆菌、出血性败血巴氏杆菌、支原体、睡眠嗜组织菌和化脓性隐秘杆菌等病原菌[6-7]。牛呼吸道疾病综合征早在北美和欧洲已有报道,近年在我国部分省区牛呼吸道传染病疫情逐年攀升[8-9]。随着动物性食品安全问题的备受关注,动物健康已是广大民众关心的问题,牛呼吸道疾病综合征在世界范围内普遍存在,病原的持续感染使机体处于免疫抑制状态,给养牛业造成巨大的经济损失。本研究对2010年7月某养牛场肉牛发生食欲下降、流鼻、体温升高、呼吸困难等症状的病例进行病理组织学观察和病原分离鉴定,并结合分离细菌的药物敏感试验结果,为该病制定科学合理的综合防控方案。

1 材料与方法

1.1 材料

病料为广西某养牛场发病死亡肉牛。20 g～25 g昆明系小鼠为广西中医学院实验动物中心提供。瑞氏染色液、革兰染色液、营养琼脂、麦康凯培养基、血琼脂培养基、细菌鉴定微量生化反应管和细菌药敏试纸均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 临床病理解剖变化观察与病料采集 记录牛群发病情况以及临床症状,对发病死亡的病例进行剖检,观察病理变化。取肺、心和脾脏等做触片,瑞特染色和革兰染色后镜检;另外迅速取病变明显的脾和肺新鲜组织放入100 mL/L中性福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,HE染色,光学显微镜观察病理组织学变化。

1.2.2 细菌分离培养与纯化 将病料(肝、心、脾)无菌接种于普通肉汤、普通琼脂、麦康凯培养基、50 g/L牛血清琼脂肉汤和鲜血琼脂培养基上,37℃培养18 h～24 h。观察细菌生长情况及菌落的形态和颜色等特征,挑取不同的单个菌落按常规方法涂片,革兰和瑞特染色后观察细菌的形态特点,并进行纯化培养。

1.2.3 细菌的生化特性试验 将纯化的细菌移接于相对应的多种细菌鉴定微量生化反应管中,37℃培养24 h,观察各个生化反应管的变化情况。

1.2.4 动物接种试验 取病料与无菌生理盐水按1∶5制成病料混悬液,2 000 r/min离心10 min后腹腔注射小鼠,分为0.5 mL/只和1.0 mL/只两个剂量组,每组3只;同时,将分离纯化的细菌菌落悬液(1.5×109CFU/mL)腹腔注射小鼠,分为0.2、0.5、1.0 mL/只3种剂量接种,每个剂量注射3只,对照组注射无菌生理盐水0.5 mL/只。接种后隔离饲养观察,记录死亡小鼠的死亡时间。

1.2.5 药敏试验 根据文献[10],参考改良Kirby-Bauer法进行试验操作。用游标卡尺测量抑菌环直径大小,按各种药敏纸片标准来判断药物的敏感性。

2 结果

2.1 发病情况与临床症状

2010年5月广西某养牛场从中国北方某省牲畜交易市场购回80头肉用牛,6、7月间零星出现牛食欲下降,流鼻,体温升高,有的剧烈咳嗽,呼吸困难,病程7 d至1月,由于治疗方法和预防措施不合理,不断出现发病死亡现象,7月底死亡数达10头。病牛听诊肺部呼吸似拉风箱,频率69次/min～73次/min,有杂音;脉搏弱,病程较长的病牛出现化脓性关节炎,粪便正常,个别在临死时有脱肛现象并伴有出血。

2.2 病理变化

对其中5头病死牛进行剖检,剖检见气管和支气管内有大量白色黏液,肺充血出血,暗红色、红色以及灰白色交替,肺尖叶和心叶边缘区出现肝变,间质增宽,切面呈大理石花纹样,并流出血水样液体或灰白色至灰黄色脓液。细支气管内有多量灰黄色至黄白色干酪样物质;心包腔积液,心冠状沟有少量胶冻状积液,心包与胸膜粘连;脾脏实质变脆,脾髓软化,切面流出血水样液体;肝脏有大量出血斑,边缘变厚,胆囊肿胀呈淡黄色,胆囊周围有黄染现象;肠系膜淋巴结肿大,充血变黑,切面不平整。

病理组织学观察结果为肺细支气管、肺泡腔内有大量的炎性渗出物,主要以中性粒细胞和浆液纤维素为主,少量的淋巴细胞、巨噬细胞,肺泡壁毛细血管扩张充血。有的病例表现为纤维蛋白性胸膜炎,肺胸膜表面被覆纤维蛋白膜,有大量成纤维细胞增生和中性粒细胞浸润,有的肺泡腔内出血,出现大量的含铁血黄素颗粒。脾小体结构不完整或消失,红髓区明显出血,其间有大量中性粒细胞浸润以及少量巨噬细胞、含铁黄素颗粒(图1)。

2.3 病料组织触片镜检结果

肺触片的瑞氏染色镜检见大量的中性粒细胞和单核细胞,球菌和小杆菌,单个或双个排列,有的成短链状排列,小杆菌呈两极着色。革兰染色可看到排列成双或呈链状、具荚膜的革兰阳性菌,还有革兰阴性的小杆菌。脾脏涂片见多量细胞成分,有大量变性坏死的淋巴细胞、单核巨噬细胞、红细胞和中性粒细胞。

2.4 细菌分离结果

将病料分别接种在50 mL/L牛血清肉汤、普通琼脂、麦康凯培养基、50 mL/L牛血清琼脂和鲜血平板上,37℃培养18 h～24 h,结果麦康凯平板上未见细菌生长;普通琼脂平板上有少量细菌生长;50 mL/L牛血清肉汤混浊,管壁有很薄的菌环,管底有黏稠的沉淀;50 mL/L鸡鲜血琼脂上有细菌生长,菌落呈细小圆形、灰白色,革兰阴性短小杆菌,也有单个小的球菌;50 mL/L牛血清琼脂平板上有细菌生长,菌落细小圆形、灰白色、湿润、露珠状,革兰染色呈阴性短小杆菌,瑞特染色两端着色明显,也有单个小球菌,有的成3个链状,革兰染色呈阳性。

用鲜血平板(含50 mL/L鸡血)对肉汤中、鲜血琼脂平板和50 mL/L牛血清琼脂平板上生长的特征性细菌进行3次纯化,结果从5头病死牛病料均分离到4种细菌,根据其菌落特征和形态特点,初步鉴定为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、牛链球菌和溶血性巴氏杆菌。所分离纯化的4种细菌在鲜血培养基上生长特征分别为:金黄色葡萄球菌生长良好,菌落较大,湿润,隆起,初呈灰白色,继而呈金黄色、白色,γ溶血,革兰染色阳性,球菌,4个或葡萄状排列;肺炎链球菌生长良好,菌落呈灰白色,直径1 mm～1.5 mm,湿润,隆起,α溶血,革兰染色阳性双球菌;牛链球菌生长良好,菌落呈圆型、扁平、灰白色、光滑,α溶血,革兰阳性球菌,菌体呈瓜子型,成对排列,也有的呈短链状;溶血性巴氏杆菌生长良好,α溶血,菌落呈淡灰白色,露珠状,湿润,针尖大小,隆起,革兰染色呈阴性的短杆菌,瑞氏染色见明显的两极浓染的椭圆形小杆菌。

2.5 生化培养特性

表1所示,4种分离细菌的生化特性表现为:金黄色葡萄球菌能水解精氨酸,可还原硝酸盐;肺炎链球菌可水解氨基酸,不能利用马尿酸钠;牛链球菌不水解精氨酸,不能利用马尿酸钠;溶血性巴氏杆菌能水解精氨酸,可还原硝酸盐等。结合生化特性和培养特性,确定从此病例分离到的病原菌是金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、牛链球菌和溶血性巴氏杆菌。

图1 肺和脾脏病理组织学变化(HE,40×)Fig.1 Histopathological changes(HE,40×)

表1 4种分离细菌的生化鉴定结果Table 1 Identification of bacterial isolates in biochemistry

(续表1)

2.6 动物接种试验

病料悬液腹腔注射接种的昆明系小鼠未出现死亡。4种分离细菌分别腹腔注射接种昆明系小鼠,72 h内均未见死亡,剖检内脏器官未见明显病理变化,但从接种小鼠肺和心血内分离到相同的细菌,证实分离的细菌在试验小鼠体内能进行增殖。

2.7 药敏试验结果

表2的药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌对试验药物均表现高度敏感;肺炎链球菌对诺氟沙星和万古霉素低度敏感,对其他药物表现中度或高度敏感;牛链球菌对头孢噻肟和卡那霉素低度敏感,对其他药物表现中度或高度敏感;溶血性巴氏杆菌对头孢类和四环素类表现中度或高度敏感,对其他药物低度敏感或耐药。

表2 四种分离菌药敏试验结果Table 2 The result of antibiotic sensitivity test(unit of diameter:mm) mm

3 讨论

据报道,在集约化养殖场,早期断奶、疲劳运输、饲料突变和恶劣养殖环境等应激因素会促使牛呼吸道合胞体病毒感染相关疫病的发生,该病易继发溶血性巴氏杆菌的感染[11]。牛疱疹病毒1型能引发动物机体的免疫抑制,病毒体外感染支气管上皮细胞可以增强溶血性巴氏杆菌的吸附感染,引起中性粒细胞的增多[12]。牛支原体常可并发或继发泰勒虫及多种细菌(金黄色葡萄球菌、溶血性巴氏杆菌、链球菌等)的混合感染,溶血性巴氏杆菌、链球菌寄生于牛的鼻咽部,增加了牛的应激性疾病,细菌代谢产物促使病原菌逃避机体的免疫,损害免疫系统和诱导严重的炎症应答[13-14]。在国内也有研究报道因运输应激而引发牛肺部金黄色葡萄球菌感染[15],或者是由于气候变化、拥挤等因素而引发犊牛呼吸道感染肺炎链球菌、犊牛链球菌性肺炎和牛出血性败血巴氏杆菌等[16-18]。

本研究结果表明,由于长途疲劳运输、南北气候温度和湿度差异、饲料突变以及饲养管理不当等应激因素的作用下,牛机体抗病力下降或上呼吸道黏膜损伤,并激发了潜在病原菌的繁殖,多种细菌混合感染,从而导致牛严重的呼吸道疾病。同时,由于发病早期治疗措施不当以及饲养管理不到位,延误治疗的最佳时机,造成发病牛症状加重甚至死亡。

在本试验中发现,4种分离细菌以及发病牛肺组织混悬液接种小鼠均未出现死亡,究其原因认为,宿主易感性不同;病原菌能否感染致病甚至引起死亡还需要其他因素协同作用;金黄色葡萄球菌广泛存在空气、土壤、饲料、物体表面,由于牛经过长途运输抵抗力下降时极易受到感染。α型溶血的肺炎链球菌、牛链球菌和溶血性巴氏杆菌多为致病力不强的条件性致病菌[19],当机体处于应激等因素作用下,抗病力下降,可能就引发了疾病的发生。有研究表明,单一溶血性巴氏杆菌或呼吸合胞体病毒引起少数羔羊轻微的呼吸道疾病和短期发热,但接种这两种病原,则引起了许多羔羊严重的呼吸道症状、精神委靡、发热和卧地等明显症状[20]。

因此,综合病理变化和分离病原菌的药敏试验结果,制定科学合理的治疗措施和饲养管理方案,加强发病牛只的抗感染治疗,改善同群牛饲养条件和早期预防措施,整个病情得到了有效的控制,没有出现新病例。

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Pathological Observation of the Case in a Cattle Farm and Isolation,Identification the Pathogenic bacteria

LIAO Su-huan,WEI Ying-yi,DENG Li-juan,HUANG Wei-jian

(College of Animal Science and Technology,Guangxi University,N anning,Guang xi,530005,China)

There was a case of beef cattles died of extremily feeble in July 2010,the sick cattles showed loss of appetite,flowing blenna narium,fever and anhelation in clinical symptoms,disease keep on 7 days to one month.In order to search for the etiological factors and find out an effective integrated control measures,we observed the histopathological changes,and isolated,identified the pathogenic bacteria from lung,spleen and other organs of five cattles among those dead cases.The main histopathologic changes were fibrinous lobar pneumonia.There were many kinds of cells infiltrating in lung bronchioles and alveolar space,including a large number of neutrophils and cellulose,and a small number of lymphocytes and monocytes.At alveolar wall there were telangiectasis and hyperaemia.We also found the splenic corpuscle diminished or even disappear,heavy bleeding and neutrophils infiltrating in splenic pulp areas.Staphylococcus aureus,Streptococcus pneumoniae,Streptococcus bovis and Pasteurella multocida were isolated from lungs,hearts and spleens of all the five dead cattles.The results of drug susceptibility test showed that Staphylococcus aureus was hypersensitive to all drugs,Streptococcus pneumoniae and Streptococcus bovis were hypersensitive to penicillins,cephalosporins and tetracyclines,and Pasteurella multocida was hypersensitive to cefotaxime,cefoperazone and vibramycin.Based on pathological changes and isolation and dentification of pathogenic bacteria,it show that the sick cattles were infected by multiple pathogens and to cause serious respiratory disease.

bovine respiratory infection;pathogenic bacteria;isolation;histopathological changes

S852.31

A

1007-5038(2011)08-0057-06

2011-05-11

食用农产品安全生产技术研究项目(沪农科攻字2010第2-5号)

廖素环(1976-),女(壮族),广西田东人,讲师,博士研究生,主要从事动物传染病病原学研究。