鸡贫血病毒全长基因感染性分子克隆的构建

李秀梅,江丽萍,郭立力,李 颖,朱雅宁,石 瑜,杨爱华,陈荣荣

(1.天津市动物疫病预防控制中心,天津 300402;2.山西农业大学,山西太谷 030801)

鸡贫血病毒全长基因感染性分子克隆的构建

李秀梅1,江丽萍2,郭立力1,李 颖1,朱雅宁1,石 瑜1,杨爱华1,陈荣荣1

(1.天津市动物疫病预防控制中心,天津 300402;2.山西农业大学,山西太谷 030801)

PCR法扩增鸡贫血病毒全长基因组,将2个全长基因组顺向连接插入到pBluescript ΠSK(+)质粒载体中,获得Psk2CAV质粒并转染MDCC-MSB1细胞,盲传4代后,用间接免疫荧光抗体试验(IFA)能检测到特异性荧光。将Psk2CAV质粒DNA于腿部肌肉接种10羽1日龄CAV阴性SPF鸡。剖检结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组均有鸡只出现腿肌、胸肌轻微出血,胸腺出现萎缩或出血。组织病理学结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组胸腺小叶萎缩,出血、淤血,髓质部萎缩,淋巴细胞减少。通过PCR可以分别从体外感染MDCC-MSB1细胞和体内感染鸡只中扩增到病毒基因片段。本研究证明含有双拷贝CAV的重组质粒Psk2CAV在体内、外均具有感染性,能衍生出病毒,并产生符合自然感染CAV的大体病变和组织病理学变化。

鸡贫血病毒;聚合酶链反应;感染性分子克隆;转染

鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)的基因组是2.3 kb的单股环状链DNA[1],由编码区和非编码区两部分组成。编码区的CAV基因组包含3个部分或完全重叠的开放阅读框(ORF),分别命名为ORF1、ORF2和ORF3,大小分别为 648,363和1 350 bp,其中,ORF1和ORF2完全重合,ORF1与ORF3部分重叠[2],分别编码 VP2(24 Ku)、VP3(14 Ku)和VP1(52 Ku)的蛋白。而非编码区内则存在一个病毒复制的调控区和一个多聚腺甘化的信号区。有关研究表明VP1是CAV的唯一结构蛋白,VP2为辅助蛋白,与病毒的装配有关,而VP3是CAV的致病性蛋白,可诱导感染细胞的程序性死亡。关于CAV生物学特性、致病机理及基因工程疫苗方面的研究在我国尚少,本研究采用分子克隆技术,成功获得CAV全长基因感染性分子克隆,为进一步研究CAV生物学特性、致病机理及研制CAV基因工程疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌(毒)株、载体和细胞 CAV Cux-1鸡胚组织毒株由德国罗曼公司提供;pBluescript SK(+)载体购自北京普京康生物科技有限公司;MDCCMSB1细胞由东北农业大学动物医学院惠赠;大肠埃希菌DH5α菌株由本实验室保存。

2.3 暴露源种类 乙型肝炎46名、占38.66%，丙型肝炎21名、占17.64%，梅毒16名、占13.45%，艾滋病7名、占5.88%，不明29名、占24.37%。

1.1.2 主要试剂 PrimeSTARTMHS DNA Polymerase,dNTPS,5×PS buffer购自宝生物工程有限公司;DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司;Biospin组织基因组DNA提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自博日科技有限公司;KpnⅠ酶、NcoⅠ酶购自纽英伦生物技术有限公司;脂质体转染试剂盒购自罗氏公司;兔抗鸡IgG荧光抗体购自Sigma公司。

1.1.3 实验动物 SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank上的CAV Cux-l株序列,设计一对引物,上游引物 P1 5′-GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3′,下游引物 P2 5′-AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3′扩增CAV全长基因组。其中,上游引物位置1 920～1 940,下游引物位置1 925～1 905,引入KpnⅠ酶切位点作为分子标签;引物由金思特科技(南京)有限公司合成。

1.2.2 重组质粒Psk2CAV的构建和鉴定

使用上海市、江苏省13个地级市和浙江省11个地级市共25个城市2005～2013年的统计数据，数据来源于《中国区域经济统计年鉴》、《上海统计年鉴》、《江苏统计年鉴》以及《浙江统计年鉴》。所有的价格型变量均根据各省的居民消费价格指数(CPI)进行了平减处理，以2003年为基期，转化为实际价格，以消除通货膨胀的影响。主要变量的描述性统计结果如表1所示。

1.2.2.3 重组质粒Psk2CAV的构建和鉴定 提取鉴定为阳性的质粒PskCAV,摸索最佳不完全酶切条件,将阳性质粒PskCAV进行不完全酶切,回收纯化不完全酶切产物,去磷酸化处理后,与1.2.2.1中处理的基因组进行连接,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞。挑取单个菌落培养,提取质粒(命名为Psk2CAV),进行酶切鉴定,同时进行测序,进一步证实两个基因组是否顺向连入载体。

间接免疫荧光检测 转染细胞传4代后,进行间接免疫荧光试验,检测病毒复制情况。具体步骤如下:取 l mL细胞悬液于 1.5 mL EP管内,1 000 r/min,离心10 min,沉淀细胞,将沉淀的细胞用pH7.4 PBS洗两遍。再用少量PBS将细胞均匀悬浮,然后涂于24孔板中央,待细胞干燥后,用冰冷的95%乙醇室温固定10 min。固定后,倒掉乙醇,用PBS洗二遍后,待细胞稍稍干燥后,加入 1∶400稀释的抗CAV的多克隆抗体,37℃孵育1 h,用PBS洗3遍,每次5 min。稍稍干燥后,加入1∶100稀释的兔抗鸡荧光抗体,37℃,30 min,用PBS洗5遍,每次5 min,晾干,荧光显微镜下观察结果。

教学原则在夸美纽斯的教育理论体系中占有重要地位，而有关教学原则的论述则是他教学理论的重要组成部分。他认为“一切知识都是从感官的感知开始的”“知识的开端，永远来自感官”他把通过感官所获得的对外部世界的感觉经验作为教学的基础，并宣布运用直观是教学的一条“金科玉律”。他认为教学应从观察实际事物开始，在不能进行直观观察时可以使用图片或模型。幼儿教育从事的是3-6岁幼儿的教育，这个时期的孩子以直觉行动思维、具体形象思维为主，因而最有效的方法是让孩子通过自己的感官去认识外部世界。

1.2.2.2 重组质粒PskCAV的构建和鉴定 将pBluescript ΠSK(+)载体用KpnⅠ进行酶切,回收纯化后,再用碱性磷酸酶处理,回收纯化后与KpnⅠ酶切的基因组建立10 μL的连接体系,过夜连接。转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,菌液涂布于Amp/LB/X-Gal/IPTG平板上,37℃培养过夜,用蓝白斑筛选重组转化体。挑取单个菌落,提取的质粒(命名为PskCAV),进行PCR,酶切及测序鉴定。

1.2.2.1 CAV全长基因组的获取 按照Biospin组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取CAV Cux-1基因组,以此为模板,用引物 P1、P2进行PCR扩增,PCR总体系为 25 μL:取 5 ×PrimeSTARTMbuffer 5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL,PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL,模板DNA 2.0 μL,上 、下游引物各 1 μL,MgCl2(25 mM)0.8μL,再用灭菌去离子水补足到25 μL;PCR反应条件:94℃5 min;98℃10 s,70℃,3 min 30 s,共30个循环;72℃10 min。扩增后产物用核酸凝胶回收试剂盒回收。回收后产物用KpnⅠ酶切、回收备用。

通过调整KpnⅠ酶的浓度及作用时间,摸索到KpnⅠ最佳不完全酶切条件,然后进行大量酶切、回收获得约5 200 bp大小的片段,回收后进行去磷酸化处理,与2 300 bp的基因组进行连接、转化,然后提取质粒进行NcoⅠ酶切鉴定,酶切结果证实两个基因组顺向连入载体中(图4),表明质粒构建成功。为进一步证实两个基因组是否为顺向连入载体,将重组质粒Psk2CAV进行测序鉴定,测序结果也证实两条目的基因顺向连入载体。

1.2.3.1 重组质粒Psk2CAV转染MDCC-MSB1细胞 按照罗氏公司脂质体转染试剂盒说明书进行,以2种DNA含量分别转染,每种浓度设两个重复。在6孔细胞培养板中,用含100 mL/L新生牛血清的RPMI-1640培养MDCC-MSB1细胞,当孔底细胞面积约70%时开始转染,孔 A1、A2 每孔转染 3.4 μg/12μL,孔 B1 、B2 每孔转染 4.2 μg/15 μL,设空质粒载体pBluescript ΠSK(+)转染作为阴性对照,设超纯水稀释的脂质体作为脂质体毒性对照,3 h后将所有培养液换成含10%新生牛血清的RPMI-1640,继续在37℃体积分数为5%CO2条件下培养。48 h后细胞长满单层,常规法分别扩大培养。

防治措施：为避免此种情况发生，一方面对于采用抛填片石黏土填充溶洞的方案要慎重，对于大型溶洞或埋深较深的溶洞，尽量采用预注浆或者钢护筒跟进的方案。对埋深浅、小溶洞采用抛填片石黏土方案具有较好的经济性，采用时要依据本文中处理措施保证土壁稳固。另外，基于溶洞内孔壁坍塌产生原因在于混凝土浇筑后侧向压力过大，所以可以采取措施减少混凝土侧向压力，例如在下放钢筋笼时在填充造壁的溶洞范围内在钢筋笼上焊接密目铁纱网或薄钢板，范围超出溶洞顶底各0.5～1m，此种方式能较好地分担部分混凝土压力，对维持孔壁稳定具有较好的效果。

“高官不如高薪，高薪不如高寿”“金山银山不如寿比南山”这些说法，广为人们接受。“健康就是幸福”“健康是人生最宝贵的财富”，成了当下大大小小医院墙体上、玻璃橱窗里广而告之的宣传用语。

1.2.4 动物试验 将Psk2CAV质粒用质粒大提试剂盒大量提取,分别于腿部肌肉接种10羽1日龄SPF 鸡,每羽鸡接种 100 μg,作为 Psk2CAV 组;用CAV鸡胚毒于腿部肌肉接种10羽鸡,每羽鸡接种100 μg,作为阳性对照;用生理盐水于腿部肌肉接种10羽鸡,每羽鸡接种100 μL,作为阴性对照。观察各组的临床表现,于接种后14 d、21 d分别剖检,做病理切片及PCR检测。PCR检测的具体步骤为:研磨肝脏,用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒提取CAV基因组。然后用Pl、P2引物进行初步PCR检测。PCR反应条件为:94℃5 min;98℃10 s,70℃,3 min 30 s,共30个循环;72℃10 min。

2 结果

2.1 CAV全长基因获取

以P1、P2为引物通过PCR,可在鸡胚组织中扩增到约2 300 bp左右的片段,与预期片段大小相符(图1)。

2.2 重组质粒PskCAV的鉴定

重组质粒PskCAV 经PCR后,可获得2 300 bp左右的片段,和预期大小相符(图2)。将重组质粒Psk-CAV 经过KpnⅠ酶切后,可见大小分别为2 300 bp和2 900 bp两条带,与预期大小相符(图3)。序列测定也证明已成功构建了CAV全长基因组的分子克隆。

2.3 重组质粒Psk2CAV的构建与鉴定

1.2.3 重组质粒Psk2CAV转染MDCC-MSB1细胞及鉴定

图1 CAV基因组PCR扩增结果Fig.1 PCR product of CAV genome

图2 重组质粒PskCAV的PCR鉴定ig.2 Identification of PCR of recombinant plasmid PskCAV

图3 重组质粒PskCAV的酶切鉴定Fig.3 Restriction identification of recombinant plasmid PskCAV

图4 重组质粒Psk2CAV的鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid PskCAV

2.4 Psk2CAV转染后的检测

将转染后的第4代细胞培养48 h后进行间接免疫荧光检测,结果见图5,说明将CAV的双基因以顺向串联的方式连入载体,可以直接转染 MDCCMSB1细胞获得有感染性的病毒。

综合这些研究成果来看，内创业过程及影响因素的研究分析很好体现出内创业行为的过程性特征，而且较好地归纳了公司层面内创业活动的纵向分布和时间顺序关系。

图5 Psk2CAV转染MDCC-MSBI细胞后的间接免疫荧光检测Fig 5 Detection of MDCC-MSB1 ceIl stransfected by Psk2CAV by IFA

2.5 动物试验

2.5.1 病理学检测 分别于接种后14 d、21 d剖检,发现阳性对照组和注射Psk2CAV质粒的试验组均有鸡只表现腿肌、胸肌轻微出血,胸腺出现萎缩或出血(见图6)。同时每组各取3只鸡的胸腺进行组织病理学检查(图7),结果显示阴性对照组胸腺无明显变化,阳性对照组胸腺小叶体积缩小,出血、淤血,髓质部萎缩,淋巴细胞减少,注射感染性克隆Psk2CAV质粒组变化与阳性对照相似。

2.5.2 PCR检测 每组各取6羽鸡的肝脏研磨后,提取基因组,用 PCR检测,阳性对照组和Psk2CAV组均扩增出2 300 bp目的条带,与预期条带相符;阴性对照组未扩增出条带(图8)。

图6 胸腺和脾脏的病理变化Fig.6 Pathogenie lesions of thymus and spleen

图7 胸腺的组织病理变化Fig.7 Lesions of thymus

图8 组织样品中PCR检测结果Fig.8 T he detection of PCR of the tissue samples

3 讨论

Fenaux M等[3]首次报道了将猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的双拷贝基因组顺向连入载体pBlue-Script中,在体外证实其有感染性以后,将其直接接种猪体,可以产生与PCV-2感染相似的病理变化。考虑到CAV与PCV基因组结构存在一定相似性,基因组都较小,以两个基因组顺向连接入载体构建感染性克隆易于操作,受其他因素影响小,因此本研究也采取将2个基因组顺向连入一个载体的策略来构建CAV感染性分子克隆。为了证实2个基因是否顺向连入载体,本研究利用CAV基因组内存在单一的NcoⅠ酶切位点,对重组质粒Psk2CAV进行NcoⅠ酶切鉴定,由于NcoⅠ位点位于基因组2 129 bp的位置,而引入的分子标签KpnⅠ位于1 899 bp位置,因此若NcoⅠ酶切后得到两条大小分别为3 400 bp、4 200 bp的片段,则证实两个基因组反向连入载体中,若NcoⅠ酶切后得到两条大小约为2 300 bP和5 200 bp的片段,则证实两个基因组顺向连入载体中。本研究中,NcoⅠ酶切鉴定结果证实两个基因组顺向连入载体,为下一步CAV感染性分子克隆的构建奠定了基础。

本试验将构建的质粒 Psk2CAV转染MDCCMSB1细胞以后第2代,进行IFA检测,可以见到稀少的阳性细胞,随着传代次数的增多,阳性细胞数越来越多,证实试验中构建的重组质粒Psk2CAV可以直接转染细胞获得有感染性的病毒。将构建的质粒Psk2CAV经腿部肌肉接种1日龄雏鸡,眼观接种鸡骨髓微黄、胸腺萎缩,组织病理学结果显示胸腺皮质萎缩,PCR检测到病毒 DNA的存在,说明Psk2CAV接种鸡体以后,病毒可以在体内复制,并引起CAV感染的病理变化[4]。因此,通过这种方法获得的病毒遗传性状稳定、均一,可以用于今后对CAV致病机理等方面的研究。

CAV自1979年首次发现以来,便因其对鸡群引起的重大损失而受到研究者的关注。CAV的主要致病机理是通过CAV编码产生的细胞凋亡因子造成造血细胞和淋巴细胞的程序性死亡[5],进而引起感染鸡贫血,出血及免疫抑制。CAV野毒感染几乎不引起典型的临床症状,但由于其免疫抑制作用,感染鸡群易并发或继发其他疾病,严重影响着养禽业的经济效益[6],然而至今仍没有理想的预防CAV感染的方法。国外学者将CAV基因组双拷贝串连在一起克隆进载体质粒后,所得到的重组质粒转染MDCC-MSB1细胞后可产生传染性的CAV[7]。这就有可能用基因工程的方法构建出能在体内复制的无致病性CAV毒株。为了尝试构建这样的毒株用作疫苗株,本研究用PCR法扩增鸡贫血病毒全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pBluescript Π SK(+)质粒载体中,成功构建了CAV全长基因的感染性分子克隆,从而为研制基因工程疫苗提供了可能。

[1]Gelderblom H,Kling S,Lurz R,et al.Morphological characterization of chicken anaemia agent(CAA)[J].Arch Virol,1989,109:115-120.

[2]Noteborn M H,de Boer G F,van Roozelaar D J,et al.Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle[J].Journal of Virology,1991,65(6):3131-3139.

[3]Fenaux M,Halbur P G,Haqshenas G,et al.Cloned genomie DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of Pig s:characterization of clinical diseas,virus distribution,and pathologic lesions[J].J Virol,2002,76(2):541-551.

[4]Y.M.Saif.禽病学[M].11版,北京:中国农业出版社,2005:202.

[5]Koteborn M H,Koch G.Chicken anaemia virus infection:molecular basis of pathogenicity[J].Avian Pathology,1995,24:11-31.

[6]McNulty M S,McIlroy S G,Bruce D W,et al.Economic effects of subclinical chicken anaemia agent infection in broiler chickens[J].Avian Diseases,1991,35:263-268.

[7]Meehan B M,T odd D,Creelan J L,et al.Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anaemia agent:sequence analy sis of the cloned replicative fo rm and transfection capabilities of cloned genome fragments[J].Arichives of Virology,1992,124:301-319.

Construction of Infectious Molecular Clone of the Full-Length DNA from CAV

LI Xiu-mei1,JIANG Li-ping2,GUO LI-li1,LI Ying1,
ZH U Ya-ning1,SHI Yu1,YNAG Ai-hua1,CHEN Rong-rong1

(1.Tianjin Animal Disease Control Centers,Tianjin,300204,China;
2.Shanxi agriculture university,Taigu,Shanxi,030801,China)

The full-length genome of CAV were amplified by PCR,and ligating two full-length genome of CAV in tandem into pBluescript ΠSK(+)vector,named as Psk2CAV,was transfected into MDCC-MSB1 cell,which IFA test showed specificity fluorescence.T hen,ten chicks were intramuscularly inoculated with 100 μg of the colned CAV plasmid.The result from necropsy illustrated that showed slight bleeding in crureus and pectorals,and atrophy or bleeding in thymusin in positive control group and Psk2CAV plasmid group.T he result of pathological section demonstrated that lobule of thymus has atrophy,bleeding and gore,medulla has atrophy,and lymphocyte has a lessening.Genome of CAV were amplified from infected MDCC-MSB1 cell in vivo and infected chick in vitro.T he results indicate that the cloned CAV genomic DNA is infectious in vivo and in vitro,and the derived virus could replicate the basic same pathological change and pathological change of CAV of natural infection.

Chicken anemia virus;PCR;infectous molecular clone;trasfection

S852.659.2;Q785

A

1007-5038(2011)08-0006-06

2011-02-13

天津市应用基础及前沿技术研究计划基础项目(08JCYBJC04700)

李秀梅(1976-),女,黑龙江依安人,兽医师,硕士,主要从事动物病毒学研究。