麦角甾苷及松果菊苷对体外培养大鼠*成骨细胞BMP2基因表达的影响

邢晓旭,刘钟杰,韩 博

(中国农业大学动物医学院,北京 100193)

麦角甾苷及松果菊苷对体外培养大鼠*成骨细胞BMP2基因表达的影响

邢晓旭,刘钟杰*,韩 博

(中国农业大学动物医学院,北京 100193)

为了观察麦角甾苷和松果菊苷对体外培养大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响。本试验采用酶消化法分离得到大鼠颅骨成骨细胞,在第3代成骨细胞中分别加入含有不同浓度麦角甾苷和松果菊苷的培养液进行培养,在培养的不同时间收集细胞、提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法观察对成骨细胞BMP2基因表达的影响。结果表明,麦角甾苷和松果菊苷均能促进大鼠成骨细胞BMP2基因的表达。

麦角甾苷;松果菊苷;成骨细胞;BMP2;荧光定量PCR

*通讯作者

随着社会老龄化的发展,骨质疏松等老年人常见的骨科疾病越来越受到人们的关注。这些常见的骨科疾病不仅影响了人们的健康,也影响了人们的日常生活。因此,如何促进骨折愈合、缩短骨折愈合周期和提高愈合质量,如何防治骨质疏松已成为骨科研究领域的热点问题。

根据中医“肾藏精,主骨,生髓”,“髓者,肾精所生,精足则髓足,髓足骨内,髓足者则骨强”的理论,采用单味补肾中药治疗骨折、骨质疏松等骨科疾病在我国已经有很长的历史。而肉苁蓉作为我国传统的补肾中药在民间已经被广泛应用,但是其在促进骨愈合、防治骨科疾病机理方面的研究却极少。

肉苁蓉又叫地精、大芸,是我国常用的一味补肾中药,具有“温而不热,补而不峻,暖而不燥,滑而不泄”的特点。在肉苁蓉的各种化学成分当中,麦角甾苷(acteoside)和松果菊苷(echinacoside)是肉苁蓉主要的两个活性成分[1]。有研究表明,在肉苁蓉中起补肾壮阳的有效成分主要是苯乙醇苷类化合物[1],而麦角甾苷和松果菊苷就是苯乙醇苷类中两个主要成分[2]。

松果菊苷具有很广泛的药理作用,具有抗氧化、保护神经、抗炎、保护肝脏、改善学习记忆和免疫调节的作用[3]。而肉苁蓉中的麦角甾苷,则具有促进淋巴细胞增殖,提高机体非特异性细胞免疫和免疫调节,从而增强免疫的功能[1]。但是对其在促进骨形成方面的研究却很少涉及。

因此,本试验通过研究中药肉苁蓉的两个主要活性成分—麦角甾苷和松果菊苷对体外培养大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响,从而来探讨补肾中药肉苁蓉在加速骨折愈合,防治骨质疏松等骨科疾病方面的机理,为临床用药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 麦角甾苷和松果菊苷购于中国药品生物制品检定所。

1.1.2 主要试剂与仪器 DMEM培养基(Gibco公司);Ⅱ型胶原酶(Sigma公司);T rizol、反转录试剂盒、P EASY-T3Cloning Kit连接试剂盒(TransGen Biotech);Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);BMP2、内参β-actin的PCR引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成);SYBR Green(TIANGEN Biotech);7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)

1.2 方法

1.2.1 大鼠成骨细胞的培养及鉴定 取10只出生24 h的大鼠乳鼠,脱颈椎处死后,采用酶消化法分离收集大鼠成骨细胞,用含150 mL/L FBS的DMEM完全培养液制成细胞悬液,置于37℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养,隔天换液,待细胞80%汇合时传代。培养的细胞采用瑞氏染色观察、碱性磷酸酶和茜素红钙化染色进行鉴定。

1.2.2 试验分组 取第三代成骨细胞,以105的密度接种于六孔板中,随机分成试验组和空白组,每组设3个重复。细胞贴壁后,经 40 mL/L FBS的DMEM维持培养基处理24 h后。对照组分别加入含有不同浓度的麦角甾苷和松果菊苷的培养液。麦角甾苷的浓度为 1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mg/mL作为试验组,松果菊苷的浓度为 5×10-4、5×10-5、5 ×10-6、5 ×10-7、5×10-8mg/mL作为试验组。对照组为不含药液的培养液,然后分别于24、48、72 h收集细胞。

1.2.3 总RNA的提取和cDNA的合成 采用T rizol法进行大鼠成骨细胞总RNA提取。按照反转录试剂盒的说明对提取的总RNA进行反转录。通过参考GenBank上大鼠BMP2和β-actin的基因序列以及已发表的文献[2,3],由上海生工生物工程技术服务有限公司合成两对特异性引物(引物序列见表1)。

表1 大鼠成骨细胞BMP2和β-actin引物序列Table 1 Sequence of primers for BMP2 and β-actin for rat osteoblast

1.2.4 基因的克隆 PCR反应后,将β-actin和BMP2的目的基因经15 g/L琼脂糖凝胶进行纯化回收,经载体连接后转入DH5α感受态细胞,经蓝白斑选择后,挑取阳性菌落克隆培养。并将阳性菌液送到北京华大基因公司进行测序。测序后将β-actin和BMP2的序列分别在GenBank中进行比对。将经过测序的菌液进行质粒纯化回收。

1.2.5 荧光定量标准曲线的构建和样品中基因的检测 β-actin和BMP2标准质粒稀释后作为模板来进行标准曲线的构建。将经不同浓度药物处理的成骨细胞cDNA作为模板,采用荧光定量PCR的方法对样品中的目的基因进行检测。

1.2.6 统计学处理 为了纠正逆转录及PCR反应效率的差异对结果的影响,最终结果用BMP2/β-actin的比值来表示。试验数据采用SPSS17.0对数据进行统计学处理,单因素方差分析组间差异性比较。

2 结果

2.1 大鼠成骨细胞的鉴定

培养48 h的细胞经瑞氏染色后(图1A),可观察到细胞呈三角形或多角形,胞质透明颗粒较少,胞核呈卵圆形,具有典型的成骨细胞形态。细胞培养48 h经碱性磷酸酶染色(图1B),可看到细胞有黑色颗粒或块状沉淀,表明细胞的胞浆中富含有碱性磷酸酶。细胞培养21 d后,经茜素红染色,可见有红色矿化结节(图1C),以上特点均符合成骨细胞的特性。通过以上方法可以证明试验中分离的细胞是成骨细胞。

图1 体外培养大鼠成骨细胞的鉴定Fig.1 T he identification of rat osteoblast vitro culture

2.2 麦角甾苷对大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响

用β-actin和BMP2标准质粒稀释作为模板制作标准曲线。用荧光定量PCR方法对经过不同浓度和药物处理的成骨细胞cDNA中BMP2含量进行检测,结果见表2。从表2中可以看出,浓度 1×10-5mg/mL的麦角甾苷与对照组相比,该浓度对成骨细胞BMP2的表达有显著的促进作用。在作用较长时间(72 h)后,各个浓度的麦角甾苷则呈现较强烈的促进作用,与24 h、48 h相比,都能不同程度的促进大鼠成骨细胞BMP2基因的表达。

表2 不同浓度的麦角甾苷对大鼠成骨细胞BMP2/β-actin比值的影响Table 2 The ratio of BM P2 to β-actin mRNA in rat osteoblasts treated with different concentrations of Acteoside

2.3 松果菊苷对大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响

从表 3可以看出,浓度为 5×10-4、5×10-6mg/mL的松果菊苷可以显著上调大鼠成骨细胞BMP2基因的表达,尤其是5×10-6mg/mL对其具有极其显著的影响。此外,不同浓度的松果菊苷在72h均可以显著促进大鼠成骨细胞BMP2基因的表达。

表3 不同浓度的松果菊苷对大鼠成骨细胞BMP2/β-actin比值的影响Table 3 he ratio of BMP2 to β-actin mRN A in rat osteoblasts treated with dif ferent concentrations of Echinacoside

3 讨论

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)属于转化生长因子β(transforming grow th factorβ,TGF-β)超家族成员。BMP 是一种可溶的、低分子跨膜糖蛋白,是唯一能够诱导异位成骨的因子,其中BMP2是最主要的骨形成调控因子,具有最高的成骨活性[4]。在骨形成的早期,BMP2可以使未分化的间质细胞向骨形成中心募集,分化为骨系细胞。还可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞也分化成骨系细胞。此外,BMP2还可以维持成骨细胞特有的细胞表型,诱导成骨细胞标志物增高。在局部注射补充BMP2,可在短期内达到预防骨折的目的,有试验表明BMP2基因的表达与老年性骨质疏松症的发病有密切的关系[5]。现在随着人们对BMP2研究的深入,有关BMP2在临床中方面的应用也越来越受到关注。

从试验结果可以看出,麦角甾苷和松果菊苷对大鼠成骨细胞表达BMP2均有促进作用。较高浓度的麦角甾苷(1×10-5mg/mL)对大鼠成骨细胞表达BMP2具有显著的促进作用。各个浓度的麦角甾苷在作用72 h后,其对BMP2 mRNA的促进作用才显现出来。松果菊苷对成骨细胞表达BMP2的作用趋势与麦角甾苷相类似。较高浓度的松果菊苷(5×10-4、5×10-6mg/mL)或是作用较长时间(72 h),其对大鼠成骨细胞BMP2基因表达呈现显著的促进作用。因此,从试验结果可以说明,麦角甾苷和松果菊苷对大鼠成骨细胞BMP2基因的表达具有促进作用,很可能是补肾中药肉苁蓉在促进骨愈合、防治骨质疏松症的机理之一。也可以说明在中药肉苁蓉的众多成分中,麦角甾苷和松果菊苷极可能是其促进骨愈合的有效成分,为进一步探讨中药肉苁蓉在治疗骨科疾病,防治骨质疏松方面提供一定的理论依据,也为中药临床用药提供一定的理论依据。

[1]李 媛,宋媛媛,张洪泉.肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展[J].中国野生植物资源,2010,29(1):7-11.

[2]陈 敏,肖苏萍,崔光红,等.管花肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定[J].中国中药杂志,2005,30(11):839.

[3]何文君,方泰惠,屠鹏飞.松果菊苷的药理研究进展[J].中国中药杂志,2009,34(4),476-479.

[4]Sawyer A A,Song S J,Susanto E,et al.T he stimulation of healing within a rat calvarial defect by Mpcl-TCP/collagen scaffolds losded with rhBM P-2[J].Biomaterials,2009,30(13):2479-2488.

[5]刘 铭.BMP-2与老年性骨质疏松的相关性实验研究[D].上海:上海第二医科大学,2002.

[6]何 伟,李自力,崔元璐,等.淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α 1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4mRNA表达的影响[J].北京大学学报:医学版,2009,41(6):669-673.

[7]郑希福.解氏金丹水丸对高脂状态下大鼠成骨细胞 BMP2、ER表达的影响[D].辽宁大连:大连医科大学,2008.

[8]王建舫.氟和骨碎补总黄酮对体外培养小鼠成骨细胞中OPG/RANKL基因表达的影响[D].北京:中国农业大学,2008.3-63.

[9]郁卫东.骨形态蛋白2在骨形成过程中的作用机制[J].中国临床解剖学杂志,2000,18(1):82-83.

[10]Jiang Y,Tu P F.Analy sis of chemical constituents in Cistanche species[J].Journal of Chromatography A,2007,1216:1970-1979.

[11]Rosen V.BMP2 signaling in bone development and repair[J].Cytokine&Growth Factor Reviews,2009,20:475-480.

[12]邹宇云.肉苁蓉对大鼠成骨细胞增殖、分化及IGF-Ⅰ基因表达的影响[D].北京:中国农业大学,2009:2-45.

[13]Lee S U,Shin H K,Min Y K,et al.Emodin accelerates osteoblast differentiation through phosphatidylinostol 3-kinase activation and bone morphogenetic protein-2 gene ex pression[J].International Immunopharmacology,2008,8:741-747.

[14]Bais M V,Wigner N,Young M,et al.BMP2 is essential for post natal osteogenesis but not for recruitment of osteogenic stem cells[J].Bone,2009,45:254-266.

[15]姚振强,曾才铭.成骨细胞的特性及起源综述[J].中国修复重建外科杂志,1996,10(4):214-216.

[16]M onica M R,Stephen J I,James N I,et al.Differential gene expression of TGF-β Family members and osteopontin in breast tumor tissue:analysis by real-time quantitative PCR[J].Breast Cancer Research and Treatment,2002,74:255-269.

[17]Thomas A L,Subburaman M,David J B.G rowth factors for bone growth and repair:IGF,T GFβand BMP[J].Bone,1996,19(1):1s-8s.

[18]李 丽,时东方,桂语歌,等.肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的抗氧化活性研究[J].安徽农业科学,2009,37(32):15835-15836.

Effects of Acteoside and Echinacoside on the Expression of the BMP2 in Rat Osteoblast

XING Xiao-xu,LIU Zhong-jie,HAN Bo

(College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing,100193,China)

In order to evaluate the effects of Acteoside and Echinacoside on the BMP2 gene expression in rat osteoblasts.Osteoblasts were isolated from calvaria in neonatal rat and were processed by the trypsin and collagenase digestion method.Then the third-generation cultured osteoblasts were exposure to different concentrations of Acteoside and Echinacoside for 24,48and 72hours,respectively.The total RNA was isolated from osteoblasts cultured in the different time and BMP2 gene expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.The result indicated that Acteoside and Echnacoside could promote the expression of BMP2 gene.

Acteoside;Echnacoside;osteoblast;BMP2;fluorescent quantitative PCR

Q786;S853.72

A

1007-5038(2011)08-0045-04*

2010-01-24

邢晓旭(1983-),女,山西太原人,硕士,主要从事中兽医学研究。