优化培养基对桑黄菌丝体生长的影响

钟 石，李有贵，朱俭勋，林天宝，吕志强，叶伟清

(1.浙江省农业科学院 蚕桑研究所，浙江 杭州 310021;2.桐庐县农技推广中心 蚕桑站，浙江 桐庐 311500)

桑黄 (Phellinus igniarius)学名鲍氏层孔菌，属担子菌亚门，层菌纲，多孔菌目，多孔菌科，针层孔菌类真菌，俗称桑臣、桑黄菇等，是寄生于桑树等阔叶树的一种药用真菌，因为具有独特的抗癌等功效，已引起国内外医药界与保健品行业的关注［1-3］。近年来，日本、韩国相继对其进行开发，主要应用于肝炎及癌症的治疗，疗效显著。据有关资料显示，桑黄对肿瘤抑制率高达96.78%，是目前国际公认的生物抗癌领域中有效率最佳的药用真菌［4-8］。

由于国内外市场对桑黄的需求量越来越大，致使国内各产地药农掠夺性采集，子实体孢子无法大量形成，野生桑黄面临枯竭。采用液体深层培养技术大规模生产桑黄菌丝体是满足国内外市场需要的有效途径。为此我们探讨了桑黄菌液体发酵的适宜培养基，以便为进一步研究液体发酵工艺及提取桑黄有效成分提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

桑黄 (Phellinus igniarius(L.ex Fr.)Quel)，由本试验室从浙江桐庐桑园桑树上寄生的野生桑黄子实体中分离。

1.1.2 试剂

乳糖、葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO4等均为国产分析纯，玉米粉、酵母粉、麦胚等提取液均为煮沸20 min后用滤布过滤制得。

1.1.3 仪器

华利达HZ-9610K冷冻振荡培养箱，Christ ALPHA 1-2LD冷冻干燥机，Mettler Toledo AL204电子天平。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养

母种选用PDA培养基;液体母种培养基为:20%马铃薯，2%白砂糖，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4。

液体菌种培养条件:液体母种用均质机1000 r·min-1匀浆处理1 min用于接种，50mL三角瓶中装液体菌种培养基 20mL，25℃，120 r·min-1振荡培养8 d。

1.2.2 氮源筛选

2% 白 砂 糖，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，pH值自然，分别以蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米粉、酵母浸出粉、麦胚粉、土豆粉为氮源，添加量 20 g·L-1。

1.2.3 碳源筛选

20%马铃薯，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，pH值自然，分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、白砂糖、红糖为碳源，添加量20 g·L-1。

1.2.4 无机盐筛选

20%马铃薯，2%白砂糖，pH值自然，以KH2PO4、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、 (NH4)3C6H5O7(柠檬酸三铵)为无机盐筛选对象，添加量为1.0 g·L-1。

1.2.5 培养基优化

以麦芽糖、酵母粉为碳、氮源，添加KH2PO4、MgSO4、柠檬酸三铵、复合维生素B，设计L18(36)6因素3水平正交试验 (表1)，优化培养基配方。

表1 L18(36)正交试验的因素与水平

1.2.6 添加桑枝提取物

在优化的培养基中分别添加桑枝提取物，添加量分别为 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%和0.8%。

1.3 测定方法

发酵液8000 r·min-1离心后收集菌丝体，用水清洗3次，冷冻干燥后称重。

2 结果与分析

2.1 培养基配方

由图1可知，不同碳源培养基培养的桑黄菌丝体生物量由大到小顺序依次为:麦芽糖＞葡萄糖＞红糖＞蔗糖＞白砂糖。

图1 碳源对桑黄菌丝体干物重的影响

不同氮源的菌丝体生长也有明显差异，以酵母粉作氮源，产量最高，达14.37 g·L-1，其次分别为酵母膏和麦胚粉，以土豆作氮源的产量最低 (图2)。

添加不同无机盐对桑黄菌丝体干物重影响较大，其中柠檬酸三铵效果较为明显 (图3)。

考虑到镁盐和磷酸盐对普通微生物发酵的重要性，选取柠檬酸三铵、KH2PO4、MgSO4作矿质元素添加。同时在培养基中添加微量复合维生素B有利于桑黄生物量的增加，随着用量的增加，菌丝体干物重反而逐渐减小 (图4)。

图2 氮源对桑黄菌丝体干物重的影响

图3 无机盐对桑黄菌丝体干物重的影响

图4 复合维生素B对桑黄菌丝体干物重的影响

2.2 培养基优化

由表2的L18(36)试验因素及水平分析可知，菌丝体生物量的最优培养基配方组合为A3B2C3D1E3F1，菌丝体生物量为 20.23 g·L-1，确定桑黄的液体深层发酵培养基配方为:麦芽糖30 g·L-1，酵 母 粉 20 g · L-1，MgSO41.5 g·L-1，KH2PO41.0 g·L-1，柠檬酸三铵 1.0 g·L-1，复合维生素B 0.01%。

表2 各处理组合对菌丝体干物重的影响

2.3 添加桑枝提取物

添加不同浓度的桑枝提取物对桑黄生物量的影响有一定的差异 (图5)，在一定范围内，随着桑枝水提物添加量的增加，菌丝体干物重也随之增加，当在培养基中加入0.3%桑枝水提物时，菌丝体干物量则达24.48 g·L-1，之后则随着添加量的增加，菌丝发生自溶现象，生物量也随之逐渐降低。

图5 添加桑枝提取物对桑黄菌丝体干物重的影响

3 小结与讨论

在我国，桑黄入药已有2000多年的历史，最早记载始于 《本草纲目》。由于桑黄生长需要较为特殊的自然气候环境，生长期长，因而天然桑黄数量非常稀少，因此采用液体深层培养技术大规模生产桑黄菌丝体将是一个有效途径。

以菌丝体干物重为基础，对野生桑黄菌丝体液体发酵的培养基营养元素 (氮源、碳源、矿物元素、复合维生素B)进行筛选，获得优化的菌丝体液体配方:3%麦芽糖，2%酵母粉，0.15%MgSO4，0.10%KH2PO4，0.10% 柠 檬 酸 三 铵，0.3%桑枝水提物，0.01%复合维生素B。

考虑寄生于桑树之上的桑黄为其中正品，因此我们在优化了高效生产桑黄菌丝体液体发酵培养基的基础上，在培养基中引入桑枝提取物，结果发现桑枝提取物不仅对桑黄菌丝体生长具有一定的促进作用，而且相对于对照组，添加桑枝提取物后，菌丝体颜色较深，不容易退化成白色，这可能是因为桑枝提取物中的某些物质可以在一定程度上延缓菌种退化的时间，至于两者之间的药效是否存在差异还有待于进一步研究。

［1］卯晓岚.中国大型真菌 ［M］.郑州:河南科技出版社，2000，465-468，477.

［2］傅海庆，陈绍军，陈汉清，等.珍稀药用菌桑黄的研究现状 ［J］.福建农业学报，2005，20(增刊):117-120.

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