正交试验法优选首乌藤多糖酶法提取工艺

董晶晶， 李晓坤， 张寒娟， 杨 云

（河南中医学院药学院，河南郑州 450008）

正交试验法优选首乌藤多糖酶法提取工艺

董晶晶， 李晓坤， 张寒娟， 杨 云*

（河南中医学院药学院，河南郑州 450008）

目的 优选并确立首乌藤多糖的最佳提取工艺。方法 利用酶解法提取首乌藤多糖，采用正交试验法进行优选，以首乌藤多糖得率和多糖量为考察指标，对首乌藤多糖的酶法提取工艺的影响因素进行研究。结果 确定首乌藤多糖的最佳提取工艺为pH 5.0，纤维素酶用量3%，酶解时间4.0 h，温度55℃的条件下酶解，酶解后进行水提的最佳条件为料液比1∶10，提取温度100℃，提取时间2.0 h，多糖得率和多糖量可达6.27%和31.02%。结论 酶解后进行水提可显著提高首乌藤多糖的提取率。

正交试验；首乌藤多糖；纤维素酶

中药首乌藤Polygoni multiflori Caulis为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥藤茎，又名夜交藤、棋藤，中医用于治疗失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛；具有养血安神、祛风通络的功能［1］。酶技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术。酶-水法提取首乌藤多糖可分为两个阶段，第一阶段为酶解过程，主要作用是促使细胞壁破裂，酶解细胞表面结构及胞间连接物，同时伴有部分糖类物质的溶出；第二阶段为水提过程，即胞内物浸出的过程，通过热水提取，既有灭酶的作用，又可使溶于热水的胞内物浸出率增加，这两个阶段在提取工艺中同等重要。本实验采用新工艺将酶解法和水提法有效的结合起来，即缩短了提取时间，又较大的提高了首乌藤多糖的提取率，为制定科学、经济的生产工艺提供理论参考。

1 材料与仪器

首乌藤药材购于河南郑州张仲景大药房，经河南中医学院生药教研室董诚明教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥藤茎；纤维素酶购于夏盛实业集团有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。岛津UV-2201紫外-可见分光光度计购于尤尼柯（上海）仪器有限公司；Sartorius BS224S万分之一精密天平购于北京赛多利斯公司。

2 方法与结果

2.1 提取方法 取首乌藤药材粉碎，过20目筛，精密称取粉末20 g，置于烧瓶中，按料液比1∶10加入水，50℃浸泡30 min，冷却后加入一定量已活化的纤维素酶（纤维素酶加10 mL水溶解，于40℃水浴活化10 min），并调溶液pH至5.0，于一定温度下水浴酶解反应一段时间后，调pH至中性，然后90℃恒温提取2 h，过滤，滤液减压浓缩至料液比1∶1.5～1∶2（原料质量∶溶液体积），80%醇沉，4℃静置过夜，离心（4 000 r/min，10 min），沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥，得首乌藤粗多糖，测定多糖量，计算多糖得率。

2.2 测定方法 用硫酸-苯酚法［2］制定含糖量标准曲线，得出回归方程为 y=0.015 6x+0.017 6，相关系数 r=0.999 5。结果表明，在20.02～70.07 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3 数据处理方法 最佳提取条件要满足多糖得率高并且糖量也高的要求，因此采用加权评分法综合评估首乌藤多糖的酶法提取工艺条件。评分标准：将各项指标除以该列最大值再乘以100，为该项得分。通过此处理，使多糖得率和多糖量转化为0～100之间的数。根据多糖得率（X）与多糖量（Y）的作用，确定两者的权重系数均为0.5，对这两项指标进行加权求和，通过公式 z=0.5x+0.5y，即得综合评分（z）。多糖得率和多糖量计算公式如下：

多糖得率（%）=所得粗多糖质量/药材质量×100%

多糖量（%）=C×D/M×100%

C：根据标准曲线回归方程求得的质量浓度（μg/mL）；D：稀释倍数；M：干燥后所得粗多糖的质量（mg）。

2.4 酶解过程正交试验及结果 根据前期首乌藤多糖酶法提取工艺研究的单因素试验结果可知，纤维素酶的最佳pH为5.0，加酶量3%，酶解时间4 h，酶解温度55℃。在上述试验的基础上，以酶解 pH 5.0作为前提条件，选择酶用量、酶解温度、酶解时间为考察因素，根据单因素试验结果，确定正交设计因素水平表，见表1。选取L9（34）正交表对提取工艺进行研究，并进行方差分析，从而确定酶解过程提取的最 佳工艺参数。正交试验结果表2，方差分析结果见表3。

表1 酶解因素水平表

表2 酶解正交试验结果

表3 酶解方差分析结果

2.5 酶解后水提过程正交试验及结果 在最佳酶解工艺参数的基础上，考察酶解后水提过程的最佳条件。根据文献报道并结合前期传统水提首乌藤多糖工艺研究［3-4］，选择提取温度、料液比和提取时间作为考察因素，每因素选取3个水平，确定正交因素水平表，见表4。以多糖得率和多糖量的综合评分为考察指标，按照L9（34）正交表对酶解后水提过程提取条件进行考察，并进行方差分析，以确定首乌藤多糖提取的最佳工艺条件。正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表4 酶解后水提工艺因素水平表

表5 酶解后水提正交试验结果

2.6 验证试验 按照正交试验选择的最佳工艺参数进行3次重复试验，操作方法同2.1项，结果见表7。首乌藤多糖平均得率和平均多糖量分别为6.27%和31.02%，多糖得率和糖量都高于传统水提法（前期研究传统水提法得到的多糖得率和多糖量分别为4.7%和24.07%），并且酶-水法提取的首乌藤多糖色泽为浅红白色，质量佳。

表6 酶解后水提方差分析结果

表7 验证试验结果

3 结论

3.1 由表2极差分析可知，影响酶解提取效果的各因素主次关系为：A（加酶量）＞B（酶解温度）＞C（酶解时间），由表3正交试验的方差分析结果可知，加酶量各水平之间有显著性差异，而酶解温度和酶解时间无显著性差异。这表明，酶用量是影响酶活性的一个重要因素，为了提高首乌藤多糖的提取率，要选择合适的酶用量值。从提取效果和经济成本角度考虑确定纤维素酶提取首乌藤多糖的最优工艺参数为：A2B1C1，即纤维素酶用量3%、酶解温度55℃、酶解时间4 h。

3.2 由表5极差分析可知，影响酶解后水提效果的各因素主次关系为：A（提取温度）＞C（提取时间）＞B（料液比），SSB和SSC均小于SSD（误差离均差平方和），该结果主要是由实验误差所引起的，这表明因素B和C对酶解后水提效果影响较小。为了提高分析精密度，常把SSB、SSC和SSD合并一起作为实验误差即SSe，相应的自由度也应合并在一起，把计算结果列入到方差分析表，见表6。计算公式如下：SSe=SSD+SSB+SSC=50.739+6.799+20.364=77.902 fe=2+2+2=6。由表6正交试验的方差分析结果可知，提取温度对结果有极其显著性影响，而提取时间和料液比影响不显著。综合多糖量、多糖得率及节省能源等因素考虑，确定酶解后正交试验优化水提过程的最优工艺条件为：A3B1C1，即料液比1∶10，提取温度100℃，提取时间2 h。

3.3 本实验中，由正交试验所确定的提取首乌藤多糖的最佳工艺为：首乌藤药材粗粉，按料液比1∶10加入水，50℃浸泡30 min，冷却后加入药材量3%的纤维素酶并调溶液pH至5.0，于55℃水浴酶解4 h，调 pH 至中性，然后100℃恒温提取2 h，过滤，提取液浓缩至料液比1∶2，醇沉，4℃静置过夜，离心得沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得首乌藤粗多糖。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：248.

［2］张惟杰.糖复合生化研究技术［M］.杭州：浙江大学出版社，1999：12-13.

［3］盛小莉，王凯平.正交设计优选当归多糖提取工艺［J］.中成药，2008，30（12）：1862-1864.

［4］杨 云，张寒娟，许小华，等.首乌藤多糖的提取工艺研究［J］.中药材，2009，32（11）：1761-1763.

R284.2

B

1001-1528（2011）07-1265-03

2010-04-27

董晶晶（1986—），女，硕士生，研究方向：中药及制剂中活性成分研究及新药开发。

* 通信作者：杨 云，女，硕士生导师，教授。Tel：（0371）65680605，E-mail：Yyun@china.com.cn