利血康抗阿糖胞苷性血小板减少症作用的实验研究

雷 红， 王 毅， 蔡亮亮， 魏 伟

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009；2.合肥恒星药物研究所，安徽合肥 230051）

利血康抗阿糖胞苷性血小板减少症作用的实验研究

雷 红1， 王 毅1， 蔡亮亮1， 魏 伟2

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009；2.合肥恒星药物研究所，安徽合肥 230051）

目的 研究利血康颗粒（三七、白及、藕节等）抗小鼠阿糖胞苷性血小板减少症模型的作用。方法 采用小鼠阿糖胞苷性血小板减少症模型，同时灌服利血康颗粒 3 种剂量 2.25、1.13、0.56 g/kg（折合生药 9、4.5、2.25 g/kg，ig）治疗 8 d，观察药物对该动物模型凝血时间、外周血血小板（Bpc）数、骨髓巨核细胞数和骨髓DNA的影响。结果 利血康颗粒高、中剂量可明显缩短阿糖胞苷性血小板减少症模型小鼠的凝血时间、升高外周血Bpc数、骨髓巨核细胞数和骨髓DNA。结论 利血康颗粒对小鼠阿糖胞苷性继发性血小板减少症模型具有拮抗作用，该作用与其促进骨髓造血干细胞尤其是骨髓巨核细胞的分化增殖，减轻骨髓抑制有关。

利血康颗粒；阿糖胞苷；血小板减少症

血小板减少症是血液内科的常见病，目前临床用于治疗血小板减少症的药物主要为肾上腺皮质激素、免疫抑制剂等。近年来越来越多的学者采用中医药或中西医结合治疗血小板减少症。因此，根据传统中医学理论，结合临床应用研究的成果，我们研制开发了利血康颗粒。利血康颗粒由三七、白及、藕节炭等组成，临床应用多例疗效良好。本实验通过复制小鼠阿糖胞苷性血小板减少症模型，观察利血康颗粒对继发性血小板减少症的防治作用，为新药研究及临床应用提供药效学依据，并探讨其升高血小板的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小白鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购于安徽省医学科学研究所实验动物中心，合格证：皖医实动准字第03号。

1.2 药物与试剂 利血康颗粒内容物（干浸膏粉），合肥恒星药物研究所提供，1 g干浸膏折合总生药4 g。阳性对照药：血康口服液，主要成分为肿节风等提取的黄酮苷、氰苷、延胡索酸、琥珀酸等，规格10 mL/支，江西天狮中药集团贵溪制药厂。注射用盐酸阿糖胞苷（Ara-C），规格50 mg/支，上海华联制药有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器 高速冷冻离心机（Beckman，HJM6）；85081型倒置光学显微镜（重庆光学仪器厂）；EL301 Strip reader酶标仪（美国BIO-TEK公司）；530紫外分光光度计（YLS-SOP-002，上海分析仪器厂）。

1.4 方法

1.4.1 小鼠阿糖胞苷性血小板减少症模型［1-2］、分组与给药 小鼠60只，随机分为6组：正常对照组、模型组、利血康颗粒高、中、低3个剂量组（2.25、1.13、0.56 g 干浸膏/kg，折合 9、4.5、2.25 g 生药/kg）、阳性对照组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，每组小鼠腹腔注射Ara-C 100 mg/（kg·d），连续2 d，第3天 ip Ara-C 50 mg/（kg·d），连续3 d。于注射同时每日灌胃给药，正常和模型对照组灌胃等容积蒸馏水，连续给药8 d。每日观察动物的一般状况、活动、感染、出血、摄食等。每周称体质量2次，并以此来调整用药量。阳性对照组小鼠ig血康口服液稀释液0.2 mL/kg。

1.4.2 凝血时间测定［3-4］于给药前1 d与末次给药1 h后毛细管眼眶取血，滴于载波片，血滴直径约5 mm，立即用秒表记时。用清洁的4号注射针头自血滴边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起，从采血开始至挑起血丝止即为凝血时间。

1.4.3 血细胞计数 剪尾采血，采用显微镜人工计数Bpc，严格按《全国临床检验操作规程》中《血小板计数》的“目视计数法”操作［5］。于给药前1 d与给药结束后1 d进行。以Bpc变化率表示结果：Bpc变化率=（给药前Bpc数－给药后Bpc数）/给药前Bpc数×100%。

1.4.4 骨髓细胞涂片检查 取一侧完整股骨，除净软组织，剪去股骨两端，取0.1 mL生理盐水反复冲洗股骨腔，将冲洗液涂片（2 cm×2 cm），经瑞氏染色，先在4×镜下全片浏览，再在10×镜下计数20个视野内的巨核细胞数，报告每个视野（10×）巨核细胞的平均数。

1.4.5 骨髓DNA测定［6］取另一侧完整股骨，除净软组织，用0.005 mol/L CaCl210 mL将全部骨髓冲入离心管中，4℃下静置30 min，离心（2 500 r/min，15 min），弃上清液，沉淀物加 0.2 mol/L HClO45 mL充分混合，90℃水浴15 min，冷却，过滤，滤液定容至15 mL，紫外分光光度计268 nm处测定吸光度A值。

2 结果

2.1 对阿糖胞苷血小板减少症小鼠凝血时间的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠凝血时间明显延长（P＜0.01）；利血康颗粒高、中剂量及血康口服液均可使凝血时间明显缩短（P＜0.01或P＜0.05）。见表1。

表1 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠凝血时间（s）的影响 （±s，n=10）Tab.1 Effect of Lixuekang Granules on coagulation time of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （¯x ± s，n=10）

表1 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠凝血时间（s）的影响 （±s，n=10）Tab.1 Effect of Lixuekang Granules on coagulation time of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （¯x ± s，n=10）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

组别 剂量 给药前/s 给药后/s正常对照 —110.79 ±33.92 116.46 ±41.67模型对照 — 121.32±40.63 257.68±53.46＊＊利血康颗粒 2.25 g干浸膏/kg 125.87 ±30.73 156.36 ±35.77*##1.13 g干浸膏/kg 117.65 ±32.71 181.28 ±43.81＊＊##0.56 g干浸膏/kg 120.49 ±41.23 216.72 ±45.83＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 109.27 ±28.31 182.39 ±51.62*#

2.2 对阿糖胞苷血小板减少症小鼠外周血Bpc的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠外周血Bpc数明显降低（P＜0.01）。利血康颗粒高、中剂量及血康口服液均可使减少的Bpc数明显升高（P＜0.01或P＜0.05），见表2。

2.3 对阿糖胞苷血小板减少症小鼠骨髓巨核细胞数的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠骨髓巨核细胞数明显降低（P＜0.01）；利血康颗粒高剂量及血康口服液均可使降低的骨髓巨核细胞数明显升高（P＜0.01），见表3。

2.4 对阿糖胞苷血小板减少症小鼠骨髓DNA量的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠骨髓DNA量明显降低（P＜0.01）；利血康颗粒高、中剂量可使降低的骨髓DNA量明显升高（P＜0.01），见表4。

表2 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠外周血Bpc的影响（±s，n=10）Tab.2 Effect of Lixuekang Granules on circulating platelet number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （¯x ± s，n=10）

表2 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠外周血Bpc的影响（±s，n=10）Tab.2 Effect of Lixuekang Granules on circulating platelet number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （¯x ± s，n=10）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

组别 剂量 给药前Bpc数/（×109/L） 给药后Bpc数/（×109/L） Bpc变化率/%正常对照 —714.44 ±139.41 677.22 ±108.87 4.07 ±12.39模型对照 — 864.50±181.01 430.80±121.26＊＊ 49.85±12.59＊＊利血康颗粒 2.25 g干浸膏/kg 973.78 ±239.28 731.44 ±147.77## 23.08 ±14.00＊＊##1.13 g干浸膏/kg 824.89 ±217.33 557.56 ±146.00 30.59 ±16.54＊＊#0.56 g干浸膏/kg 762.10 ±239.74 483.50 ±210.33* 36.89 ±14.99＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 818.13 ±178.42 544.25 ±111.62* 32.34 ±14.46＊＊#

表3 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠骨髓巨核细胞数的影响（±s，n=10）Tab.3 EffectofLixuekang Granuleson marrow megakaryocytes number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （¯x ± s，n=10）

表3 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠骨髓巨核细胞数的影响（±s，n=10）Tab.3 EffectofLixuekang Granuleson marrow megakaryocytes number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （¯x ± s，n=10）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model group.

组别 剂量 骨髓巨核细胞数/（个/视野）正常对照 —1.08 ±0.38模型对照 — 0.31±0.09＊＊利血康颗粒 2.25 g干浸膏/kg 0.80 ±0.20##1.13 g干浸膏/kg 0.38 ±0.26＊＊0.56 g干浸膏/kg 0.34 ±0.09＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 0.80 ±0.30##

表4 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠骨髓DNA的影响（±s，n=10）Tab.4 Effect of Lixuekang Granules on marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice（¯x ± s，n=10）

表4 利血康颗粒对阿糖胞苷血小板减少症小鼠骨髓DNA的影响（±s，n=10）Tab.4 Effect of Lixuekang Granules on marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice（¯x ± s，n=10）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

组别 剂量 骨髓DNA量吸光度A值正常对照 —0.667 ±0.112模型对照 — 0.396±0.046＊＊利血康颗粒 2.25 g干浸膏/kg 0.546 ±0.107*##1.13 g干浸膏/kg 0.475 ±0.036＊＊##0.56 g干浸膏/kg 0.442 ±0.095＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 0.398 ±0.057＊＊

3 讨论

血小板减少症病因可为继发性如化疗药物、放射治疗引起，或原发性如特发性血小板减少性紫癜（ITP）等。化疗药物引起的血小板减少，多与其抑制骨髓造血干细胞，尤其是骨髓巨核细胞的分化增殖有关［7］。阿糖胞苷临床上用于治疗急性粒细胞白血病和肿瘤；其通过阻碍核酸代谢和DNA合成，抑制骨髓造血干细胞，引起血小板减少，故可用于造成继发性血小板减少动物模型的实验研究［2］。

利血康颗粒是由三七、白及、藕节炭等组成的中成药，来源于古方“安血饮”加减，功具活血化瘀，收敛止血之效，可用于瘀血内阻之出血证。本实验通过小鼠阿糖胞苷性血小板减少症动物模型，研究了利血康颗粒治疗继发性血小板减少症的作用及其机理。结果表明，利血康颗粒可明显延长阿糖胞苷性血小板减少症模型小鼠的凝血时间、升高外周血血小板数，并可升高骨髓巨核细胞数和骨髓DNA量。说明利血康颗粒对小鼠阿糖胞苷性血小板减少症模型具有明显的治疗作用；其作用机理与其促进骨髓造血干细胞，尤其是骨髓巨核细胞的分化增殖，减轻骨髓抑制有关。本实验为利血康颗粒用于继发性血小板减少症的治疗提供了药效学依据。

［1］王安行，朱家谷.血康胶囊升血小板和白细胞作用的实验研究［J］.浙江中西医结合杂志，1998，8（3）：144-145.

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［3］陈 奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1994：484-484.

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［5］中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程［M］.南京：东南大学出版社，1997：22-23.

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［7］都丽萍，梅 丹.药源性血小板减少症的发病机制和临床表现及防治［J］.药物不良反应杂志，2007，9（6）：414-419.

Experimental study on anti-cytarabine（Ara-C）-induced thrombocytopenia effect of Lixuekang Granules

LEI Hong1， WANG Yi1， CAI Liang-liang1， WEI Wei2
（1.College of Biological and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Hefei Hengxing Pharmaceutical Institute，Hefei 230051，China）

AIMTo explore the effect of Lixuekang Granules（Notoginseng Radix et Rhizoma，Bletillae Rhizoma，Nelumbinis Rhizomatis Nodus，etc）on mice model of cytarabine（Ara-C）-induced thrombocytopenia.METHODSAra-C-induced thrombocytopenia mice model was adopted.The model was intragastrically given three doses of Lixuekang Granules 2.25，1.13，0.56 g/kg（equivalent to 9，4.5，2.25 g/kg crude drugs）for eight days simultaneously.Coagulation time of mice，circulating platelet counting，marrow megakaryocytes counting and marrow DNA content were investigated.RESULTS2.25，1.13 g/kg of Lixuekang Granules could shorten the coagulation time，elevate circulating platelet counting，marrow megakaryocytes counting and marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice markedly.CONCLUSIONLixuekang Granules have the effect of anti-secondary thrombocytopenia induced by Ara-C，which may be related to its promoting differentiation and proliferation of marrow hemopoietic stem cells，especially marrow megakaryocytes and alleviating marrow inhibitory effect.

Lixuekang Granules；cytarabine（Ara-C）；thrombocytopenia

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1113-03

2010-07-21

雷 红（1973—），女，副教授，博士，硕士生导师，研究方向：天然产物纯化与作用机理。E-mail：leihong66@sohu.com