姜黄对大鼠子宫内膜异位症影响的实验研究

陈 蓉， 陈景龙， 方 毅， 张沁舒， 段 恒*

（1.重庆医科大学中医药学院，重庆400016；2.澳大利亚国立大学John Curtin医学研究院）

姜黄对大鼠子宫内膜异位症影响的实验研究

陈 蓉1， 陈景龙2， 方 毅1， 张沁舒1， 段 恒1*

（1.重庆医科大学中医药学院，重庆400016；2.澳大利亚国立大学John Curtin医学研究院）

目的 通过中药姜黄对子宫内膜异位症的内膜组织血管内皮生长因子（VEGF）、金属蛋白酶（MMP）-9的表达，探讨其治疗机理。方法 采用SD雌性大鼠子宫内膜自体移植建立模型，成功建模3周后，随机分为模型组（B组，n=10）；孕三烯酮组（C组，n=10）；姜黄组D组，n=12）、以假手术为空白对照组（A组，n=8），各组分别给药3周后，检测异位子宫内膜组织VEGF、MMP-9的表达。结果 C、D两组均降低异位内膜组织VEGF、MMP-9的表达，与B组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），C、D组间P＞0.05，无明显差异。结论 姜黄可能是通过降低VEGF、MMP-9的表达，而抑制模型大鼠异位内膜的生长、致其萎缩，达到实现治疗的目的。

姜黄；子宫内膜异位症；VEGF；MMP-9

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMS）是妇科学中公认的难治性疾病之一，虽为良性疾病，但其浸润、转移和复发的生物学行为与恶性肿瘤有相似之处。其发病机制至今尚未阐明，促其种植和生长的因素亦未明确，发病趋势呈逐年上升［1］。西医治疗副作用较大，中医治疗EMS，目前使用中药复方汤剂治疗的报道比较多，中药复方大七气汤［2］、异位宁［3］、三棱丸［4］等，而单味中药治疗 EMS 较少。姜黄是一种活血化瘀的中药，近年来受到许多学者的关注，其主要药理作用包括抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、抗HIV病毒等，且毒性很低［5］，还有人报道姜黄素有抑制EMS微血管密度的作用［6］，我们在临床运用单味姜黄以及姜黄复方汤剂治疗子宫内膜异位症痛经、包块等疗效较好。为了解其治疗机理，本研究通过模型动物实验，检测其异位组织形态学变化和血管内皮因子（VEGF）、金属蛋白酶（MMP-9）的表达，以观察姜黄对子宫内膜异位症治疗作用及其机制。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级SD大鼠，雌性，鼠龄（70±5）d，体质量（200±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007-0001。

1.2 药物 中药姜黄，购于重庆桐君阁康平大药房，经重庆医科大学中医学院中药教研室何先元副教授鉴定认可。煎熬前加自来水冷水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次30 min，将两次汤液煎煮浓缩精制为含生药1 g/mL中药汤剂，冷却后放冰箱保存。孕三烯酮胶囊购于北京紫竹药业有限公司，批号：53050104，规格为每粒 2.5 mg。

1.3 试剂 免疫组织化学SP试剂盒、抗VEGF抗体、和DAB显色剂等均购于北京中杉金桥公司，抗MMP-9抗体购自于Santa Cruz公司。

1.4 主要仪器 紫外可见分光光度仪（英国AmershamBiosciences公司），eppendorf centrifuge 5415D高速冷冻离心机（德国）；电泳及转膜装置（北京六一仪器厂）；Elecsys 2010电化学发光酶联免疫分析仪（美国Roche公司）；倒置显微镜及图像采集系统（日本Nikon公司）等。

2 实验方法

2.1 EMS动物模型的建立 将大鼠适应性喂养3 d后，随机取40只EMS造模，用自体内膜移植方法建立大鼠EMS动物模型［7］。以阴道脱落细胞涂片检测大鼠性激素周期，在大鼠动情期以10%的水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉，常规消毒后，开腹，结扎一侧子宫两端，剪取长约12 mm的子宫段，剪成4 mm×4 mm的子宫组织3块。1块送病理检验，另2块缝于腹壁、肠壁，以黏膜面朝向腹壁、肠壁。术毕每只大鼠肌注庆大霉素0.1 mL/8万U，连续3 d。正常饲料喂养3周后，打开腹腔观察移植的异位内膜生长情况，以异位病灶呈结节状，或形成囊状，囊内有无色透明液体，囊泡体积≥10 mm3或囊内形成多个串珠状，周围可见丰富血管形成，表明造模成功。40只大鼠，术后死亡3只，成功建模32只，建模成功率80%。

另取同样8只清洁级SD雌性大鼠，作为空白对照组，进行开腹后关腹假手术。假手术造模方法手术条件及麻醉、开腹方法均同EMS模型组，开腹后分别结扎右侧子宫两端，剪下中间的一段子宫丢弃，逐层缝合各层组织。术后仍然每只大鼠肌注庆大霉素0.1 mL/8万U，连续3 d，预防感染。

2.2 分组与给药 将32只建模成功大鼠随机分为3组，B组：模型组（n=10）；C组：孕三烯酮西药组（0.5 mg/kg，n=10）；D 组：姜黄组（5 g/kg，n=12）。8只假手术大鼠设为A组：对照组（n=8）；对照组和模型组给予等量生理盐水，每天灌胃给药1次，连续给药3周。3周后，同样麻醉下打开腹腔，取出子宫内膜异位组织，用10%的福尔马林液固定待检测。

2.3 观察指标

2.3.1 组织形态学检查 将取出的异位内膜组织24 h内分别常规脱水后，透明、浸蜡、包埋、切片，经HE染色在光镜下观察组织学形态。

2.3.2 测定VEGF、MMP-9的表达 按试剂盒说明书要求进行免疫组织化学法测定各组的VEGF、MMP-9。将每张切片随机选取4个视野拍照，图片用Image-Pro Plus软件进行分析。以棕黄色表示阳性为标准，计算每张图片的光密度值，最后计算出累积光密度值。

3 结果

3.1 肉眼观察 造模大鼠移植物外观空白对照组与造模成功3周时相似，但EMS模型组移植物外观体积增大，呈囊状内含有液体，有的内见血丝，有的呈透明状，有的移植物表面有丰富血管形成，移植物与周围组织呈广泛黏连。姜黄组、孕三烯酮西药组的异位子宫内膜腺体均见体积明显变小，腺腔变窄，细胞稀疏，分泌物较少，成萎缩状。

3.2 镜下观察

3.2.1 造模后 对照组与模型子宫内膜相比，异位的子宫内膜其上皮细胞内常见空泡，间质变得较疏松，间质内毛细血管增生明显；正常子宫内膜上皮细胞为高柱状或柱状，黏膜层内间质细胞分布均匀，腺体数量多，腺腔完整，腺上皮细胞多为柱状，见图1。

图1 对照组子宫内膜与模型组异位子宫内膜组织结构（×400）Fig.1 The structures of normal endometrium and ectopic endometrium of rat（×400）

3.2.2 姜黄治疗后 给予姜黄治疗后与模型组比较异位内膜组织上皮萎缩，血管减少，腺体数目减少，腺腔萎缩，间质细胞小而稀疏。见图2、图3。

图2 姜黄治疗EMS模型大鼠后，VEGF在异位子宫内膜中的表达情况（×400）Fig.2 The expression of VEGF in ectopic endometrium of rat after treatment

图3 姜黄治疗EMs模型大鼠后，MMP-9在异位子宫内膜中的表达情况（×400）Fig.3 The expression of MMP-9 in ectopic endometrium of rat after treatment

3.3 免疫组化观测VEGF和MMP-9累计光密度值的表达 结果见表1。

表1 各组间VEGF和MMP-9累计光密度值（IOD）的表达 （±s）Tab.1 The relative IOD of endometrium（±s）

表1 各组间VEGF和MMP-9累计光密度值（IOD）的表达 （±s）Tab.1 The relative IOD of endometrium（±s）

注：与模型组相比较，*P ＜0.05。Note：*P ＜0.05 vs model group.

组别 n VEGF MMP-9对照组 8 1.26 ±0.21* 1.58 ±0.44*模型组 10 189.38 ±11.52 131.08 ±27.00孕三烯酮组 10 11.63 ±5.73* 25.35 ±5.89*姜黄组 12 11.9 ±0.47* 0.69 ±0.12*

表1结果显示：C组、D组与B组比较异位组织的 VEGF、MMP-9 的表达，P＜0.05，差异具有统计学意义；而C、D间比较无显著性差异（P＞0.05）。

4 讨论

EMS的形成，血管生存是其基本条件。VEGF是一种多肽类细胞因子，可直接作用于组织血管内皮细胞，刺激内皮细胞生长，导致新生血管的形成［8-9］。MMPs是一组蛋白水解酶，有破坏与降解细胞外基质（ECM）的作用，MMP-9能促进血管内皮细胞的出芽，导致新生血管的形成；侵犯基底膜细胞外基质，并种植于腹膜［10-11］。VEGF和MMP-9是影响EMS的发生、发展过程重要因素，这一点也是学术界达成共识的。

因此本研究通过姜黄对EMS动物模型的作用，以了解其治疗机理。异位内膜组织中VEGF、MMP-9的高表达，经本实验姜黄干预后其表达均显著下降。各组与模型组相比肉眼、镜下组织形态变化，VEGF、MMP-9表达情况有明显差异，说明VEGF和MMP-9在EMS的发病及异位内膜宫外转移种植过程中具有重要作用，其表达下降从而降低异位内膜的种植、侵袭能力。

EMS发病机理中医认为是“血瘀”所致，姜黄源于《新修本草》［12］，药物性味辛、苦、温。它辛温行散，苦以开泄，归肝、脾经。有活血行气，通经止痛的功效，现代药理研究，姜黄能抑制血小板聚集降低血黏度、抗炎、抗肿瘤等作用。因此它可减轻盆腔组织的黏连及瘀肿，使冲任通畅，EMS得到控制和恢复。研究VEGF、MMP-9及其在EMS中的表达调节，对寻找针对的中药药物，为治疗EMS开辟新的治疗途径。本实验结果表明，经姜黄干预后其 VEGF、MMP-9均明显下降，具有抑制异位内膜VEGF表达而达到抑制异位子宫内膜生长，促进其萎缩，说明姜黄可能是通过抑制VEGF、MMP-9等的调节，纠正机体的瘀血状态，抑制异位血管生成，改善盆腔循环，而达到治疗EMS的目的。

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［12］高学敏主编.中药学［M］.北京：中国中医出版社，2007：368.

Effect of Curcuma on expressions in endometriosis rats

CHEN Rong1， CHEN Jin-long2， FANG Yi1， ZHANG Qin-shu1， DUAN Hen1*

（1.Departement of Traditional Chinese Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.The John Curtin School of Medical Reseach，The Australian National University，Canberra，Australia）

Curcuma；endometriosis；VEGF；MMP-9

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1145-04

2011-01-11

重庆市自然科学基金（CSTC，2008BB5217）；教育部“春晖计划”教外司留（2009）525号

陈 蓉（1963—），女，硕士，副教授，研究方向：妇科肿瘤、不孕症。

*通信作者：段 恒（1977—），女，博士，研究方向：女性生殖健康。Tel：13512337203，E-mail：CR8093@126.com