HPLC法同时测定四逆汤中3种有效成分的含量

高志祥，姜笑寒，王岩，王琳，姜志明，孟繁浩

（1.中国医科大学药学院药物化学教研室，沈阳 110001；2.广东省食品药品职业技术学校，广州 510663；3.沈阳军区总医院医学实验科，沈阳 110015）

四逆汤为张仲景所创名方，始载于《伤寒论》，为历版中国药典所收载的成方。本方由附子、干姜、甘草组成，配伍极为精简严谨。其功效为回阳救逆，主治少阳病。症见阳虚欲绝、冷汗自出、四肢厥逆、恶寒倦卧、呕吐不渴、腹痛下利、神衰欲寐、舌苔白滑、脉象微细等症。在现代临床中应用广泛，并均收到良好的疗效。其方剂也成为现代中药研究的首选之一［1］。现代医学认为四逆汤有强心、抗休克、保护受损伤心血管系统、抗血脂及对病理状态下的机体有免疫调节等多种药理作用［2］，同时还具有保护肠黏膜及脑缺血等疗效［3］。研究表明乌头类生物碱既是其强心作用的有效成分又是其毒性成分［4］。为了更好的控制该药品的内在质量，保证临床用药的安全有效，本研究选用乌头碱、新乌头碱和次乌头碱作为四逆汤质量控制的指标，采用高效液相色谱法对其成分进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂：Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），Agilent 1200系列双元泵，Agilent 1200可变波长检测器，Agilent 1200化学工作站；SB25-120超声清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）；乌头碱对照品（批号：110720-200410）、新乌头碱对照品（批号：799-9403）和次乌头碱对照品（批号：798-9403）均有中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯，三乙胺为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%三乙胺（65∶35），流速为 1.0 mL·min-1，检测波长为240 nm，柱温为30℃。

1.2.2 对照品溶液的制备：采用十万分之一天平精密称取乌头碱对照品3.01 mg、新乌头碱对照品1.03 mg、次乌头碱对照品2.02 mg，置于一10 mL瓶中，加入甲醇使溶解并稀释刻度，混匀，得到混合对照品贮备液。

1.2.3 供试品溶液的制备：参照中国药典（2005年第一部）第422页方法制成四逆汤，减压浓缩成稠膏状。加入甲醇使溶解并超声提取10 min，放至室温，加入甲醇定容至10 mL，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，即得。

1.2.4 阴性样品的制备：按1.2.3项下的方法不加附子制备而成。

1.2.5 系统适用性实验：在“1.2.1”的色谱条件下进样，以乌头碱、新乌头碱、次乌头碱色谱峰计算，理论板数均在5 000以上时，色谱峰对称因子0.95~1.05，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱色谱峰与其他成分分离度大于1.5。

1.2.6 线性关系的考察：精密量取混合对照品贮备液适量，采用逐级稀释法配制成分别含乌头碱301、150.5、60.2、30.1、6.02 μg/mL，新乌头碱 103、51.5、20.6、10.3、2.06 μg/mL，次乌头碱 202、101、40.4、20.2、4.04μg/mL的系列混合对照品溶液。照“1.2.1”项下的色谱条件进样20μL，测定峰面积。以对照品浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）做线性回归。

1.2.7 精密度试验：取同一混合对照品溶液，连续进样5次，测定峰面积。乌头碱、新乌头碱和次乌头碱峰RSD分别为0.79%、0.37%、0.90%。

1.2.8 稳定性试验：取批号为201001的供试品溶液分别于 0、4、8、16、24 h 进样 20 μL，测定峰面积。乌头碱、新乌头碱和次乌头碱峰RSD分别为0.29%、0.32%、0.64%。

1.2.9 重复性试验：取批号为201001供试品，精密称定5份，测定含量。乌头碱、新乌头碱和次乌头碱含量的RSD分别为1.05%、0.94%和0.98%。

1.2.10 回收率试验：取批号为201001的样品，精密称定6份，分别置10 mL量瓶中，精密加入19μg/mL乌头碱对照品溶液1 mL，10μg/mL新乌头碱对照品溶液1 mL，400μg/mL次乌头碱对照品溶液1 mL，定容至10 mL。依法测定，计算回收率。乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的平均回收率分别为100.74%（RSD=1.88%）、99.9%（RSD=2.98%） 和 102.9%（RSD=1.32%）。

2 结果

2.1 对照品、供试品及阴性样品的色谱图见图1。

图1 对照品溶液（A）、供试品溶液（B）阴性样品（C）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards（A），sample（B）and feminine sample（C）

2.2 样品的测定

按照中国药典2005年版一部422页方法制备四逆汤样品5批，按“1.2.3”项制备供试品溶液，照“1.2.1”项下的色谱条件测定，采用外标法计算含量，见表1。

3 讨论

3.1 流动相的选择

流动相选用甲醇-0.1%三乙胺（65∶35），葛尔宁等［5］也进行过相关研究，以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100∶50∶3∶0.15）为流动相，其流动相较复杂。本方法创新之处在流动相中去掉了塑形剂氯仿，分离效果良好，而且流动相更为温和，有利于色谱柱的长期使用，方法简便可行。同时通过考察不同比例的甲醇-0.1%三乙胺（50∶50；55∶45；60∶40；65∶35）对分离效果的影响，结果表明甲醇-0.1%三乙胺（65∶35）对3种生物碱的分离最好。

3.2 提取时间的选择

生附子中的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱均为剧毒生物碱，有报道称3 mg的乌头碱即可以使人死亡［6］，因此提取时间的选择就显得尤为重要，提取时间过短则剧毒性乌头碱含量过大，过长则有效成分的活性会大大降低。葛尔宁等在研究过程中发现四逆汤中附子、干姜和甘草在滚煎时70 min中后乌头碱的含量减半。线性范围大大增大、更有利于对四逆汤进行质量控制。

表1 四逆汤样品含量测定结果（n=5）Tab.1 The quantitative results of Sinitang（n=5）

［1］王晓琳.中药方剂“四逆汤”分析［J］.中医中药导报，2010，7（6）：104.

［2］刘平，葛迎春，马天舒.四逆汤类方药理研究进展［J］.辽宁中医杂志，2007，34（2）：248-251.

［3］商李超，郁宝生.四逆汤的药理作用研究进展［J］.中西医结合心血管病杂志，2009，7（11）：1333-1335.

［4］肖凤霞，周莉玲，李锐.四逆汤制剂中乌头生物碱的药动学相关性研究［J］.中药材，2005，28（7）：587-588.

［5］葛尔宁.通脉四逆汤毒性分析［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12（5）：12-14.

［6］中国医学科学院药物研究所.中药志［M］.2版.北京：人民卫生出版社，1982：138.