顶空气相色谱法测定头孢泊肟酯中三乙胺的残留量

王晨 顾江军 李东伟 崔晨辉 王晶,* 王彦广

(1 浙江大学，杭州 310027；2 浙江华方药业股份有限公司，台州 318020)

头孢泊肟酯是第三代口服广谱头孢菌素，临床上主要用于上、下呼吸道感染、泌尿道感染、妇科及外科感染等的治疗，具有治疗剂量小、给药次数少、耐受性好、副作用小等优点[1-2]。在原料药生产中，合适的溶剂可以提高产率和药物质量，有机溶剂是药物合成中必不可少的组分。但是，当药品所含的残留溶剂水平高于安全值时，会对人体产生危害，因此对残留溶剂的控制受到越来越多的关注[3]。常用的生产头孢泊肟酯的工艺中主要用到四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、三乙胺等有机溶剂[4-7]，中国药典自2010版开始收录头孢泊肟酯[8-9]。近年来，也陆续有文献报道头孢泊肟酯中的残留溶剂的检测方法[10-11]。但是，目前尚未见测定头孢泊肟酯中三乙胺残留量的报道。虽然三乙胺的限度标准在美国药典和中国药典的正文均没有硬性规定，但均在凡例中要求凡工艺用到的溶剂需检验。由于三乙胺具有助溶和轻度的防腐作用，因此需要控制其残留限度[12]。目前三乙胺已收载于人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)，Q3C(R6)中[13]，规定其限度为5000ppm，欧洲药品质量管理局(EDQM)也规定其残留限度为320ppm，因此为控制头孢泊肟酯的质量，本着从严控制的原则，本文计划将三乙胺的残留量控制在320ppm。本文参照中国药典2015年版通则0861残留溶剂检查法，建立了一种简便灵敏、准确可靠的检测三乙胺残留量的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

(1)Aglient 7890B气相色谱仪，7697A顶空气相色谱仪，FID检测器；(2)ME204E电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 样品及试剂

(1)三乙胺，分析纯，临安青山化工试剂厂，批号：20140109；(2)二甲基亚砜，分析纯，Honeywell，批号：DN861；(3)供试品：头孢泊肟酯(CPDP)，浙江华方药业股份有限公司提供；批号：20151201、20151202和20151203。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Elite-5-AMINE(30m×0.32mm, 1.5μm)；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；柱温：程序升温，初始柱温50℃，保持10min，再以20℃/min的速率升至200℃，保持5min；进样口温度：200℃；检测器温度：250℃；载气：N2；载气流速：2.0mL/min；进样体积：1.0mL；分流比：5:1；平衡温度：80℃；平衡时间：30min；进样阀温度：90℃；传输管温度：100℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液的配制

精密移取1.0mol/L NaOH溶液5mL，置于20mL顶空瓶中，再精密移取二甲基亚砜1mL，置于该顶空瓶中，加盖密封，摇匀，作为空白溶液。

2.2.2 对照品溶液的配制

精密移取三乙胺63.7mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀，作为对照品母液；精密移取对照品母液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密移取对照品储备液5mL，置于20mL顶空瓶中，再精密加入二甲基亚砜1mL，加盖密封，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的配制

取供试品0.1g，精密称定，置于20mL顶空瓶中，精密移取1.0mol/L NaOH溶液5mL，使其溶解，再精密移取二甲基亚砜1mL，置该顶空瓶中，加盖密封，作为供试品溶液。

2.2.4 回收率测试液的配制

精密称取供试品80.3、101.3和120.4mg，分别置于20mL顶空瓶中，精密移取1.0mol/L NaOH溶液5mL，使其溶解，再精密移取二甲基亚砜1mL，置于顶空瓶中，加盖密封，分别标记为样品空白1～3溶液。

精密称取三乙胺50.2mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀；精密移取该溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，摇匀，作为对照品储备液1；精密称取供试品80.4、80.3和80.8mg，分别置于20mL顶空瓶中，精密移取5mL对照品储备液1，使其溶解，再精密移取二甲基亚砜1mL，加盖密封，摇匀，分别标记为回收率测试液1～3。

精密称取三乙胺63.7mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀；精密移取该溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，摇匀，作为对照品储备液2；精密称取供试品100.5、101.3和101.7mg，分别置于20mL顶空瓶中，精密移取5mL对照品储备液2，使其溶解，再精密移取二甲基亚砜1mL，加盖密封，摇匀，分别标记为回收率测试液4～6。

精密称取三乙胺77.8mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀；精密移取该溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，摇匀，作为对照品储备液3；精密称取供试品122.4、121.7和122.5mg，分别置于20mL顶空瓶中，精密移取5mL对照品储备液3，使其溶解，再精密移取二甲基亚砜1mL，加盖密封，摇匀，分别标记为回收率测试液7～9。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性试验

取“2.2.2”项下对照品溶液连续顶空进样6次，记录色谱图。结果三乙胺峰理论塔板数在28000左右，均大于5000，三乙胺峰与相邻峰的分离度在35以上，均大于1.5，三乙胺峰面积的相对标准偏差为4.23%，小于10%，符合要求。

2.3.2 专属性考察

取“2.2”项下空白溶液、对照品溶液和供试品溶液分别进行顶空气相色谱分析，记录色谱图。结果表明，空白溶液对测定无干扰；供试品溶液中各组分分离良好，三乙胺未检出，三乙胺处无干扰，其它组分对三乙胺测量无干扰，方法专属性良好，色谱图见图1～3。

2.3.3 检测限和定量限的测定

精密移取“2.2.2”项下对照品储备液，逐级稀释，进样分析，当三乙胺峰的信噪比(S/N)约为3时，得三乙胺的检测限为0.0265μg/mL，换算样品浓度后相当于0.0001%，结果见表1。

精密移取“2.2.2”项下对照品储备液，逐级稀释，进样分析，记录三乙胺峰的信噪比(S/N)约为10时，得三乙胺的定量限为0.0796μg/mL，换算样品浓度后相当于0.0005%，结果见表2。

2.3.4 线性范围试验

精密移取“2.2.2”项下对照品母液0.1、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，配制成相当于10%、50%、80%、100%、150%和200%对照品储备液浓度的溶液，摇匀；精密移取上述各溶液5mL，置于20mL顶空瓶中，再精密加入二甲基亚砜1mL，加盖密封，摇匀，进行顶空气相色谱分析，以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，进行线性回归，得线性方程：Y=92.624X+23.077，r=0.9992(表3和图4）。

2.3.5 准确度(回收率)试验

取“2.2.4”项下样品空白1、2、3溶液，回收率测试液1～9分别进行顶空气相色谱分析，记录色谱图，以外标法计算三乙胺的量，同时计算三乙胺的回收率，结果表明，三乙胺的回收率在95%～105%范围内，平均回收率为100.16%，回收率的相对标准偏差为3.38%，符合要求，结果见表4。

2.3.6 精密度(重复性)试验

图1 空白溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of blank solvent

图2 供试品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of sample

图3 对照品和供试品混合溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of mixed solution of reference substance and sample

表1 三乙胺检测限Tab.1 The limit of detection of triethylamine

表3 线性试验结果Tab.3 Linear test result

表2 三乙胺定量限Tab.2 The limit of quantitation of triethylamine

图4 三乙胺线性回归曲线Fig.4 Standard curve of triethylamine

按“2.2.2”项下对照品溶液的配制方法配制对照品溶液，进样测定，记录色谱图，平行操作6次，结果三乙胺峰面积的RSD为1.67%(n=6)，表明方法精密度好，结果见表5。

2.3.7 耐用性考察

在其他条件不变的情况下，分别单独改变起始柱温、流速、色谱柱，考察测试结果不受影响的程度。考察了流速分别为1.8、2.0和2.2mL/min，起始柱温分别为45、50和55℃，同一型号不同编号的色谱柱时，三乙胺峰理论板数，分离度和峰面积RSD。结果表明，改变以上单一色谱条件时，三乙胺峰理论板数均大于5000，三乙胺峰与相邻峰的分离度均大于1.5，峰面积RSD均小于10%，符合要求，方法耐用性良好。

2.3.8 样品的测定

取“2.2.3”项下供试品溶液顶空进样，记录色谱图，采用外标法计算样品中三乙胺的含量，测定结果为未检出，结果见表6。

表5 精密度试验数据Tab.5 Results of precision test

表4 三乙胺回收率数据Tab.4 Results of recovery test of triethylamine

表6 样品检测结果Tab.6 Results of sample determination

3 讨论

3.1 进样方式的选择

气相色谱法有顶空进样和直接进样两种方式，考虑到三乙胺的沸点较低，适宜采用顶空进样法测定[12,14]，且顶空进样法对仪器、系统污染小，对仪器维护保养更有利，因此选择顶空进样。

3.2 色谱柱的选择

先后试验了HP-5毛细管柱(30m×0.32mm, 0.25μm)和DB-624毛细管柱(30m×0.53mm, 3μm)，对空白溶液、对照品溶液分别顶空进样，发现三乙胺的理论塔板数符合要求，但是拖尾因子均大于2.0，分别为4.03455和3.63697，拖尾比较严重，难以准确积分；采用色谱柱Elite-5-AMINE(30m×0.32mm, 1.5μm)时，三乙胺峰形明显改善，三乙胺的理论塔板数和拖尾因子都符合要求，且甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃和甲苯等溶剂对三乙胺均无干扰，非常适合测定三乙胺的残留量。

3.3 溶媒介质和计算方式的选择

已知三乙胺是有机碱，可以选择NaOH溶液作为溶剂[15]，而头孢泊肟酯在碱性溶液中会发生水解，产生头孢泊肟酸，会降低NaOH溶液的浓度，影响到三乙胺的峰面积。实验中发现，当增加NaOH的浓度时，头孢泊肟酯水解消耗的NaOH对体系pH影响不大，三乙胺的峰面积影响不大，可以选择外标法计算三乙胺的含量。因此，选择1.0mol/L NaOH溶液为溶剂，以外标法计算三乙胺的残留量。