随年龄增长心肌线粒体PT孔开放改变及其机制*

赵淑琴，王秀静，张世忠，曹 阳，陈慧颖，李从德

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)孔是位于线粒体内膜上的一种非特异孔道[1]。近年来国内外的研究发现它在细胞死亡和/或凋亡的启动或终止以及缺血/复灌损伤的发生、发展和转归过程中都具有关键作用[2]。研究发现在老年小鼠的肝脏和淋巴细胞，线粒体上PT孔较易于开放的现象[3]，这一发现提示线粒体PT孔与衰老有联系[4]。由于在心肌衰老退化过程中，往往伴随心肌细胞的死亡和凋亡，因此有理由推测，线粒体PT孔可能在心肌的自然衰退中扮演重要的角色。基于此，本研究对不同月龄SD大鼠心功能自然衰退过程中线粒体PT孔开放改变以及诱发其改变的相关机制进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验分组

SD大鼠(32只，购自同济医学院)分为3、6、9、12月龄4组(n=8)，各组大鼠雌雄各半。

1.2 心功能检测

将SD大鼠(雌雄各半)用水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉，固定于鼠手术台。实验过程中，大鼠体温保持在37℃，每隔30min定量补充麻药(0.016 g/kg，)以维持麻醉状态。在颈部作正中切口，暴露气管，作气管插管并接呼吸机(潮气量为2 ml，呼吸频率为70counts/min)，然后分离大鼠右侧颈总动脉，将颈总动脉插管一端与压力传感器相连，另一端缓慢插入颈总动脉直至左心室，用Biopac16道生物信号记录系统记录左室收缩压(left ventrucular systolic pressure，LVSP)、左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室压上升/下降最大速率±dp/dtmax(the maximal rate of rise/fall of left ventricular pressure)。

1.3 线粒体形态学检测

梯度离心法分离心肌细胞的线粒体，10%福尔马林固定，切片电镜观察线粒体形态。

1.4 线粒体PT孔开放检测

以梯度离心法分离心肌细胞的线粒体，以200μmol/L Ca2+，诱发MPTP孔的开放，采用线粒体基质肿胀法检测520nm处线粒体吸光度的减小速度和幅度，持续观察线粒体TP孔开放状态变化10min。

1.5 线粒体Mn-SOD活性检测

梯度离心法分离心肌细胞线粒体，各组心肌线粒体Mn-SOD活性用试剂盒(购自南京建成)检测。

1.6 统计学处理

采用SPSS13.0软件进行分析，实验结果以均数±标准差()表示，多组间均数比较用ANOVA和 Newman-Keuls法分析。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能检测

随大鼠月龄增加，9月龄和12月龄大鼠心室功能开始出现减退改变，同 3月龄大鼠相比，LVSP减小(P＜0.01)，LVEDP增高(P＜0.01)，+dp/dtmax和-dp/dtmax均明显减小(P＜0.01，表 1)。

2.2 线粒体形态学检测

电镜形态学检测显示，本实验所用的心肌线粒体分离方法得到的心肌线粒体呈圆形，电子密度较高，外膜光滑完整，内脊排列整齐，完整无断裂，线粒体内无基质肿胀(图1)。

2.3 各组线粒体PT孔开放检测结果

随大鼠月龄增长，心肌线粒体PT孔开放程度(图2 A)和开放速率(图2B)逐渐增加，6月龄大鼠心肌线粒体PT孔开放速率增加与3月龄比具有统计学差异(P＜0.05)，9月龄和12月龄大鼠线粒体PT孔开放速率增加尤为明显，同3月龄大鼠相比具有显著差异(P＜0.01)。

Tab.1 Cardiac function measurement of rats from different months(，n=8)

Tab.1 Cardiac function measurement of rats from different months(，n=8)

M:Month;LVSP:Left ventrucular systolic pressure;LVEDP:Left ventricular end-diastolic pressure;HR:Heart rate;+dp/dt max:The maximal rate of rise of left ventricular pressure;-dp/dt max:The maximal rate of fall of left ventricular pressure**P＜0.01 vs 3M group;##P＜0.01 vs 9M group

Month LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) HR(beat/min) +dp/dt max(mmHg/s) -dp/dt max(mmHg/s)3 126.81±10.92 -1.04±0.21 424.71±63.72 3063.52±307.51 -3319.13±401.946 143.34±11.62 -4.77±0.79** 413.86±27.53 3695.23±223.25** -3624.53±319.979 89.04±12.35** 5.53±1.26** 423.67±27.45 2040.24±385.55** -2100.52±136.73**12 85.03±3.07** 17.00±3.00## 375.71±63.02 1679.53±225.27** -1372.42±215.45##

Fig.1 Electrograph of mitochondria from rat heart(×50k)

Fig.2 Changes of mitochondrial PT pore opening with month in-creasing

2.4 各组线粒体Mn-SOD活性检测结果

除6月龄大鼠外，随大鼠月龄增长，心肌线粒体Mn-SOD活性逐渐减小，其中9月龄和12月龄大鼠心肌线粒体Mn-SOD活性减小显著，与3月龄和6月龄大鼠相比具有显著统计学差异(P＜0.01，图3)。

Fig.3 Activity of Mn-SOD from mitochondria in different months group

3 讨论

在衰老机制的研究中，线粒体功能障碍与衰老的关系受到极大的关注，这方面的研究文献积累已相当丰富。总的观点认为，线粒体是细胞ROS产生的主要场所，线粒体产生过多的ROS可造成线粒体DNA(mtDNA)的氧化应激损伤和呼吸链功能障碍，呼吸链功能障碍又可使线粒体产生更多的ROS，这三者相互联系在一起形成一个恶性循环，逐渐发展导致线粒体功能障碍并最终损害细胞的功能和活性[5]。这些研究结果表明，线粒体功能障碍确实与衰老有着密切的联系。

MPTP孔是位于线粒体内膜上的一种非特异孔道。近年来国内外的研究发现它在细胞钙稳态调节、细胞死亡和/或凋亡的启动或终止以及缺血/复灌损伤的发生、发展和转归过程中都具有关键作用。由于在心肌衰老退化过程中，往往伴随心肌细胞的死亡和凋亡，因此有理由推测，线粒体PT孔在心肌的自然衰退中扮演重要的角色。

为验证这一推测，本实验分别对3、6、9、12月龄大鼠心功能进行检测，并对线粒体PT孔开放状态进行同期检测，从而动态观察了在心功能自然衰退过程中PT孔开放状态改变。

我们的研究结果表明，线粒体PT孔开放随大鼠月龄增加而呈逐渐增大的趋势，其中9月龄和12月龄大鼠PT孔开放程度明显增强。对不同月龄大鼠心功能的检测表明，9月龄和12月龄大鼠心功能开始明显减退。据此，我们推测，心肌线粒体PT孔开放改变是先于心功能减退发生而出现的一个生理现象，从心功能减退时心肌线粒体PT孔开放程度明显增加的实验结果推测，心肌线粒体PT孔开放增强有可能是诱发心功能减退的一个重要生理启动机制。

实验中，我们检测到随月龄增加，大鼠线粒体Mn-SOD活性总体呈下降趋势，其中在9月龄和12月龄心功能减退大鼠的下降尤为明显，因此推测线粒体抗氧化能力的减退可能是造成线粒体PT孔开放改变的一个重要因素，但是尚需进一步通过实验证实。另外，线粒体PT孔开放诱发心功能减退的确切机制还有待于进一步研究。

[1]Bernardi P，Forte M.The mitochondrial permeability transition pore[J].Novartis Found Symp，2007，287:157-164.

[2]Gomez L，Li B，Mewton N，et al.Inhibition ofmitochondrial permeability transition pore opening:translation to patients[J].Cardiovasc Res，2009，83(2):226-233.

[3]Rottenberg H，Wu S.Mitochondrial dysfunction in lymphocytes from old mice:enhanced activation of the permeability transition[J].Biochem Biophys Res Commun，1997，240(1):68-74.

[4]Crompton M.Mitochondria and aging:a role for the permeability transition[J].Aging Cell，2004，3(1):3-6.

[5]Hiona A，Leeuwenburgh C.The role of mitochondrial DNA mutations in aging and sarcopenia:implications for the mitochondrial vicious cycle theory of aging[J].Exp Gerontol，2008，43(1):24-33.