联合补充维生素B1、B2、PP对急性低氧暴露小鼠物质代谢的改善作用*

刘 晋，郭长江，吴健全，杨继军，韦京豫，高蔚娜

(1.卫生学环境医学研究所，天津 300050;2.总后军需装备研究所，北京 100010)

高原地区低压、低氧、寒冷等特殊环境因素对机体生理功能、营养代谢等均产生十分显著的影响，初入高原后，主要症状有头痛、恶心、食欲减退、消化吸收功能下降等。一些研究表明，补充水溶性维生素可以提高机体的耐缺氧能力，补充大剂量烟酰胺或以水溶性维生素为主的复合维生素可以提高动物的急性耐缺氧能力;补充3倍于正常需要量的维生素B1、B2、PP能有效改善动物的能量代谢。我们前期的研究证明补充含有大剂量B族维生素的复合营养制剂可以有效提高小鼠急性密闭缺氧生存时间[1]，并提高初入高原青年的血氧饱和度及改善心肺功能[2]。维生素提高机体耐缺氧能力的确切作用机制目前还不是十分清楚，理论而言，低氧暴露者通过合理补充维生素，可以达到预防营养缺乏病，改善营养状况的目的，从而间接提高机体耐缺氧能力，但是，有关研究结果显示，这些维生素还可通过其他途径发挥抗缺氧的作用。本文在上述研究基础上，围绕与能量代谢相关的三种主要水溶性维生素---维生素B1、B2、PP，探讨了急性低氧导致的三大营养素物质代谢的改变及联合补充维生素B1、B2和PP对这种改变的改善作用及对能量代谢产生的影响，从而初步揭示联合补充这三种维生素提高机体耐缺氧能力作用的代谢机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与饲养

雄性昆明小鼠50只(体重14～16 g)，由军事医学科学院实验动物中心提供。在清洁级动物房饲养，室内温度(25±2)℃，相对湿度30%～40%，适应性喂养3 d后随机分为正常对照组、缺氧对照组、2倍、4倍 、8 倍维生素 B1、B2、PP 补充组 ，每组 10只 。正常对照组和低氧对照组采用基础饲料喂养，基础饲料按照美国AIN-93成年啮齿类动物饲料配方配制[3](每千克基础饲料中含维生素B1、B2、PP分别为5 mg，6 mg，30mg)，三个剂量补充组饲料是在基础饲料中联合补充维生素B1、B2和PP，使其含量分别提高至基础饲料的2倍、4倍和8倍。各组动物以相应饲料喂养2周，自由摄食及饮水。

1.2 低氧暴露方法

各组动物以相应饲料喂养2周后，正常组仍在常压动物房饲养，低氧组动物进入低压氧舱进行模拟高度为6000m的暴露，过程如下:以1000m/min的速度由海平面高度上升至5000m，停留3 min;再以500m/min速度上升至6000m，停留8 h;此后再以500m/min速度下降至5000m，停留 3 min，再以1000m/min的速度下降至海平面高度[4]。眼眶后静脉丛采血，取1 ml全血抗凝后用于ATP含量测定，剩余血液离心取血清，同时迅速剥离肝脏组织于冷凝管中，全血、血清及肝脏组织均迅速置于-20℃冰箱保存。

1.3 检测指标

血清血糖、乳酸、丙酮酸、游离脂肪酸采用化学比色法测定，均使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。肝糖原测定采用蒽酮法，血清尿素氮测定采用二乙酰-肟法。血清β-羟丁酸采用酶联免疫法测定，USCN LIFE SCIENCE&TECHNOLOGY公司提供试剂盒。全血ATP含量测定采用化学发光法，使用北京康润诚业生物科技有限公司出品的试剂盒。

1.4 统计处理

2 结果

2.1 各组动物碳水化合物相关代谢物变化

与正常对照组相比，低氧组中血清葡萄糖、乳酸、丙酮酸和肝糖原水平均显著升高，补充2倍维生素后，除乳酸外，其它三个指标与正常对照组比仍显著升高;4倍和8倍维生素补充组，除丙酮酸外的三个指标均降低至与正常对照组比无显著性差异的水平(表1)。

Tab.1 Changes of serum glucose，lactic acid，pyruvate and liver glycogen contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

Tab.1 Changes of serum glucose，lactic acid，pyruvate and liver glycogen contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal

Normal 9.53±2.64 8.10±3.23 0.40±0.03 1.21±0.47 Hypoxia 12.42±1.84* 11.68±2.39* 0.56±0.06** 2.10±0.68*2 times 12.02±2.07* 9.79±2.68 0.54±0.08** 2.15±0.76*4 times 10.17±3.16 10.27±2.97 0.51±0.07* 1.80±0.478 times 11.66±2.08 10.13±2.19 0.48±0.11* 1.87±0.73

2.2 各组动物蛋白质及脂类相关代谢物变化

低氧暴露后，反映蛋白质分解水平的血清尿素氮及脂肪动员情况的血清游离脂肪酸和β-羟丁酸水平均显著升高，补充2倍维生素后有降低的趋势，但尿素氮和血清游离脂肪酸与正常对照组比仍显著升高，4倍和8倍维生素补充组中，三个指标均继续呈现不同程度降低的趋势(表2)。

2.3 各组动物全血ATP含量结果

全血ATP含量低氧后降低，补充2倍、4倍、8倍维生素B1、B2、PP后呈不同程度的升高趋势，其中8倍补充组效果最好(图1)，但无统计学显著意义。各组全血ATP含量分别是:正常对照组为(1.31±0.54)mmol/mg Hb，低氧对照组(0.96±0.27)mmol/mg Hb，2倍组(1.08±0.25)mmol/mg Hb，4倍组(1.06±0.31)mmol/mg Hb，8倍组(1.21±0.18)mmol/mg Hb。

Tab.2 Changes of serum urea nitrogen，free fatty acids and β-hydroxybutyric acid contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

Tab.2 Changes of serum urea nitrogen，free fatty acids and β-hydroxybutyric acid contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

*P＜0.05 vs normal

Group Urea nitrogen(mmol/L)Free fatty acids(μmol/L)β-hydroxybutyric acid(nmol/L)Normal 11.51±1.41 670.20±254.36 10.63±0.46 Hypoxia 13.58±1.81*1606.61±295.51*11.61±0.68*2 times 13.07±1.17*1474.95±636.26*11.14±1.084 times 12.91±1.49 1154.93±338.11 11.05±0.688 times 12.84±1.31 1093.67±386.67 10.77±1.17

Fig.1 Changes of blood concentration of ATP in mice exposed to acute hypoxia

3 讨论

本实验观察到急性低氧暴露后小鼠血糖、丙酮酸、乳酸和肝糖原水平较正常对照组显著升高，全血ATP含量降低，但差异无显著性，说明在急性低氧条件下，能量产生途径发生改变，血糖有氧氧化分解供能被抑制，糖的代谢被迫由有氧氧化向无氧酵解转移，机体通过增强无氧酵解来适应缺氧环境，导致丙酮酸和乳酸的生成增多，ATP的生成减少。另外，在急性低氧环境下，基础代谢率升高使ATP的消耗增加[5]，Howald等证明，缺氧导致细胞线粒体结构破坏，从而造成能量代谢障碍[6]，所以全血ATP含量降低，血糖含量的升高会使肝糖原分解作用减弱、合成作用相对增强，肝糖原含量随之升高;血清尿素氮水平升高，提示蛋白质分解代谢加强;血清游离脂肪酸和β-羟丁酸水平升高，一般认为是脂肪氧化分解增强的结果[7]，当ATP的生成量不足以维持机体能量的需要时，脂肪动员增强，酮体生成量增多，成为脑和肌肉组织的主要能源，以维持机体正常的生理功能，也有研究显示，急性和慢性高原低氧暴露会显著降低大鼠肉碱棕榈酰转移酶(CPT-1)活性，限制长链脂肪酸转运至线粒体进行氧化的过程，造成血清游离脂肪酸含量升高[8]。

联合补充维生素B1、B2、PP 后，血糖 、肝糖原、血清丙酮酸、乳酸水平较低氧对照组有不同程度的降低趋势，全血ATP含量有所升高，这个结果进一步支持向丹英等人的结论，表明补充维生素后，碳水化合物的有氧氧化增强，无氧酵解减弱，氧气的利用率提高，有利于能量生成，这与维生素 B1、B2、PP 作为糖酵解及三羧酸循环关键酶的辅酶，综合影响物质代谢过程有关。维生素B1的辅酶形式--焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate，TPP)，是丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、转酮醇酶的辅酶，Fumagalli等对正常人缺氧时静脉注射TPP 100mg，观察到该措施可以改善呼吸功能，提高组织对氧的利用能力[9]，这表明缺氧时自身TPP不能满足机体代谢需要，补充维生素B1有助于促进丙酮酸氧化脱羧，从而使三羧酸循环正常运转，促进糖的有氧氧化。维生素B2的活性形式--黄素腺嘌呤二核苷酸FAD和黄素单核苷酸FMN，是丙酮酸脱氢酶复合物、α-酮戊二酸脱氢酶复合物，琥珀酸脱氢酶和脂酰CoA脱氢酶的辅酶，维生素PP(烟酰胺)的辅酶形式--NAD+、NADH、NADP+、NADPH，是各种脱氢酶的辅酶，参与了体内上百种氧化还原反应，NAD作为电子受体参与了糖酵解及三羧酸循环，另外有研究证明，烟酰胺还可以通过调节线粒体相关抗细胞凋亡信号通路来增加急性低氧暴露神经细胞的生存力，减少并逆转低氧造成的神经细胞损伤[10]。

血清游离脂肪酸、β-羟丁酸含量也随着维生素B1、B2、PP 的补充而有降低趋势，说明脂肪酸的β-氧化和酮体的利用增强，提示我们维生素B1、B2、PP可能具有改善急性低氧条件下脂肪氧化不全的状况。血清尿素氮含量也有下降趋势，说明急性低氧条件下，维生素B1、B2、PP的补充可以使蛋白质分解减少，节约了蛋白质。

综上所述，本研究显示急性低氧暴露后小鼠三大营养素代谢发生了显著的变化，补充维生素B1、B2、PP对这种变化具有一定的改善作用。补充剂量不同，所测指标有差别的原因，可能是2倍补充剂量较低，尚不足以有效改善急性低氧暴露造成的物质代谢的变化。总体来看，因急性低氧暴露引起的代谢变化有随着补充剂量的加大而改善的趋势，补充正常饲料含量4倍剂量的维生素即可显示明显的改善效果。因此，急性低氧环境下，应增加维生素B1、B2、PP的摄入量。有关上述三种维生素改善急性低氧暴露后物质代谢的作用机制，尚有待于从酶活性或基因表达水平进行深入研究。

[1]郭长江，杨继军，韦京豫，等.提高急性耐缺氧能力的复合营养制剂研究[J].高原医学杂志，2004，14(4):1-3.

[2]韦京豫，郭长江，杨继军，等.复合营养素制剂对高原青年营养状况与耐低氧能力的干预作用[J].中国应用生理杂志，2007，23(2):16-19.

[3]Reeves P G，Nielsen F H，Fahey G C Jr.AIN-93 purified diets for laboratory rodents:final report of the american institute of nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J].J Nutr，1993，123(11):1939-1951.

[4]王宇平，郭长江，杨继军，等.急性低氧暴露小鼠外周血代谢组变化分析[J].中国应用生理杂志，2009，25(2):177-180.

[5]Westerterp K R.Energy and water balance at high altitude[J].News Physiol Sci，2001，16:134-137.

[6]Howald H，Pette D，Simoneau J A，et al.Effect of chronic hypoxia on muscle enzyme activities[J].Int J Sports Med，1990，11(suppl 1):s10-14.

[7]Roberts A C，Butterfield G E，Cymerman A，et al.Ac-climatization to 4，300-m altitude decreases reliance on fat as a substrate[J].J Appl Physiol，1996，81(4):1762-1771.

[8]Kennedy S L，Stanley W C，PanchalA R，et al.Alterations in enzymes involved in fat metabolism after acute and chronic altitude exposure[J].J Appl Physiol，2001，90(1):17-22.

[9]Fumagalli G，Mezzano M.Effects of cocarboxylase on respiration during acute hypoxia[J].Riv Med Aeronaut，1957，20(4):619-631.

[10]Chong Z Z，Lin SH，Li F.The sirtuin inhibitor nicotinamide enhances neuronal cell survival during acute anoxic injury through AKT，BAD，PARP，and mitochondrial associated“anti-apoptotic” pathways[J].CurrNeurovasc Res，2005，2(4):271-285.