慢性间断性低氧大鼠认知功能和脑胆碱能神经元的进行性变化*

陈 燕，赵春玲，张春来，徐 倩

(泸州医学院生理教研室，四川 泸州 646000)

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是临床上常见的疾病之一。研究发现[1，2]，无论是成人还是儿童，OSAS均可引起不同程度的认知功能障碍。目前，OSAS引起认知功能障碍的具体机制尚不明确，但多数学者认为慢性间断性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)对OSAS患者认知功能障碍的发生发展起着重要作用。研究表明，学习记忆功能与相关脑区神经递质的含量及代谢改变有密切关系。慢性间断性低氧发生过程中，与学习记忆密切相关脑区的神经递质会发生怎样地进行性变化，并且这种变化与学习记忆功能的进行性变化是否一致，目前尚未见相关报道。因此，本研究通过动态观察慢性间断性低氧过程中大鼠学习记忆功能及前额叶皮层、海马胆碱能神经元的动态变化，以期探讨慢性间断性低氧对大鼠学习记忆功能的进行性影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用SD雄性大鼠40只(泸州医学院动物科提供)，体重(250±20)g，随机均分为 4组(n=10):对照组、CIH1周组、CIH3周组和CIH5周组。

1.2 动物模型制作

参照薛全福等[3]制作的慢性间断性低氧大鼠模型。将大鼠置于自制的有机玻璃舱内，舱壁留有小缝隙与舱外相通，使舱内气压与大气压平衡。向有机玻璃舱内充入氮气，用数字测氧仪监测舱内氧浓度。每次低氧开始时氧浓度从23%降至8%±1%，用时10min。低氧舱内二氧化碳浓度始终＜3%，温度保持(22±2)℃，每天低氧 8 h，连续低氧 1、3、5周。低氧期间大鼠摄食、饮水同常。

1.3 学习记忆能力测试

对各组大鼠分别进行连续7 d的Morris水迷宫(购自成都泰盟科技有限公司)测试，以评价大鼠学习记忆功能变化情况，分为以下3个实验:(1)定位航行实验(水下隐匿平台):实验平台在水面下2 cm，放置在西北方向恒定位置。实验室内灯光亮度恒定。随机按四个方向将大鼠放入水中，同时记录大鼠游泳轨迹和时间。一旦大鼠到达平台，时间和轨迹记录就终止。让大鼠在平台上停留30s后，离开迷宫休息4 min，随后又开始另一轮实验，直到4个象限都测试完毕。如果大鼠在120s内不能找到平台，则将其放到平台上30s，在实验记录上记下时间120s。该测试连续进行5 d。(2)定位航行实验(水上可见平台):实验平台在水面上2 cm，记录大鼠找到平台的时间，并让其在平台上停留30s。该测试连续进行2 d。(3)空间搜索实验(无平台):将平台移出迷宫，大鼠从远离平台方向的任一点放入迷宫，记录其在60s中的游泳轨迹，计算其在目标象限停留时间占整个游泳时间的百分率。本实验紧接在水上可见平台实验第2天完成后进行。

1.4 标本制备

Morris水迷宫测试结束后，各组大鼠用乙醚麻醉后，迅速打开胸腔，暴露心脏。用生理盐水快速灌注冲洗至右心耳流出液清亮，然后用4%多聚甲醛灌注固定。灌注完成后取出脑组织标本，在视交叉后缘、大脑脚与桥脑交界处把脑冠状切为三块，置于4℃4%多聚甲醛中后固定8～12 h，石蜡包埋。

1.5 坏死神经元计数

石蜡连续切片，厚度为4μm，间隔5张取1张，常规HE染色，在光镜下观察，并在前额叶皮层取3个400倍视野进行坏死神经元计数并求平均值;对海马CA1、CA3、齿状回的全部坏死神经元进行计数。

1.6 ChAT免疫组化检测

石蜡连续切片，厚度为4μm，间隔5张取1张，对前额叶皮层和海马进行抗ChAT多克隆抗体的免疫组织化学标记。步骤为:石蜡切片脱蜡和水化后，PBS液冲洗5 min×3次;3%H2O2滴加在切片上，室温静置10min;PBS液冲洗5 min×3次;预热的枸橼酸钠缓冲液水浴修复15 min;PBS液冲洗5 min×3次;滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液;滴加兔抗ChAT多克隆抗体50μl(进口分装，购自上海朗顿生物科技有限公司)，置4℃冰箱过夜;37℃复温45 min;PBS冲洗2 min×3次;滴加二步法非生物素检测试剂盒中的试剂1(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育20min;PBS冲洗2 min×3次;滴加二步法非生物素检测试剂盒中的试剂2(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育20min;PBS冲洗2 min×3次;DAB显色、脱水、透明、封片。阴性对照用PBS液代替。

1.7 图像分析

ChAT免疫组化反应产物定量分析采用光密度值OD表示，OD值的大小反应产物的多少。利用显微镜照相系统拍摄前额叶皮层和海马ChAT阳性表达情况，并利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对其进行分析。各组每一只大鼠脑切片的前额叶皮层随机选取3个400倍视野，分别测定其中阳性染色的OD值，求其平均值，作为该大鼠前额叶皮层的OD值。海马则分别在齿状回、CA1、CA2、CA3和CA4区随机选取3个400倍视野，分别测定其中阳性染色的OD值，求其平均值，作为该大鼠海马的OD值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试结果

2.1.1 定位航行实验结果 各组前4个训练日逃避潜伏期随时间变化逐渐缩短，第5个训练日开始成绩趋于稳定。RANOVA统计结果:组内因素(训练天数)F=121.029，P=0.000，而交互效应(训练天数×组别)F=1.633，P=0.753，提示逃避潜伏期有随时间变化的趋势，但时间因素的作用不随分组不同而不同。组间因素效应的方差分析示组间因素(组别)F=3.218，P=0.000，提示分组因素起作用，各组逃避潜伏期总体而言不同。进一步多重比较提示，与对照组比较，CIH5w 组第 1、2、3个训练日逃避潜伏期明显延长，差异具有显著性(P＜0.05)，CIH1周组和CIH3周组逃避潜伏期延长，但差异无显著性(P＞0.05)。CIH各组逃避潜伏期随着低氧时间延长呈逐渐延长趋势;组间比较，CIH1周组和CIH5周组第1、2、3个训练日逃避潜伏期差异具有显著性(P＜0.05，图1)。

Fig.1 Comparison of escape latency among four groups in place navigation

2.1.2 空间搜索实验结果 与对照组比较，CIH1周组和CIH3周组大鼠在平台所在象限停留时间百分比减少，但差异无显著性(P＞0.05);CIH5周组大鼠停留时间明显减少，差异具有显著性(P＜0.05)。CIH各组在平台所在象限停留时间百分比随着低氧时间延长而逐渐减少，组间比较差异无显著性(P＞0.05，图 2)。

Fig.2 Percentage of time spent in the quadrantwhere the original platform of the control group and CIH groups in spatial probe

2.2 前额叶皮层、海马坏死神经元计数结果

HE染色后，在光镜下观察到对照组前额叶皮层和海马神经元大小、形态正常。CIH各组前额叶皮层和海马出现不同程度的神经元变性坏死，表现为细胞明显肿胀，胞浆出现空泡，细胞核皱缩，细胞内成分消失，胞体深染。与对照组比较，CIH各组前额叶皮层和海马坏死神经元数增多，并且随着低氧时间延长，上述改变呈进行性加重趋势(表1)。

Tab.1 Quantity of necrosis neurons in prefrontal cortex and hippocampus(，n=10)

Tab.1 Quantity of necrosis neurons in prefrontal cortex and hippocampus(，n=10)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CIH1week group;△P＜0.05 vs CIH 3week group

Group Prefrontal cortex CA1 CA3 Dentate gyrus Control 2.00±1.89 1.00±0.74 2.00±1.56 3.10±2.56 CIH1w 10.50±3.57* 3.20±1.62 4.30±1.89 7.70±4.94 CIH3w 30.40±9.74*# 9.20±5.87*# 7.50±4.14*# 11.80±6.09*CIH5w 49.00±11.55*#△ 19.70±9.92*#△ 11.20±4.44*#△ 30.60±10.56*#△

2.3 前额叶皮层和海马ChAT阳性细胞表达结果

ChAT免疫组化阳性表达定位于胞浆中，呈棕黄色颗粒，与背景对比度明显，胞核不着色，经苏木素复染为蓝色。阴性对照实验未见着色。与对照组比较，CIH1周组前额叶皮层和海马ChAT阳性表达减少，但差异无显著性(P＞0.05);CIH3周组和CIH5周组前额叶皮层和海马ChAT阳性表达明显减少，差异具有显著性(P＜0.05)。CIH各组前额叶皮层和海马ChAT阳性表达随着低氧时间延长呈进行性下降趋势;组间比较，CIH1周组与CIH3周组海马ChAT阳性表达差异具有显著性(P＜0.05)，CIH1周组与CIH5周组前额叶皮层和海马ChAT阳性表达差异具有显著性(P＜0.05，表2、图3和图4，见彩图页Ⅱ)。

3 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是一种发病率较高的慢性睡眠呼吸疾患，在成年人中的发病率为2%～4%，是多种全身疾病的危险因素[5]。认知功能障碍是OSAS患者神经系统受损的主要表现之一。大量临床观察显示，慢性间断性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是引起患者认知功能障碍的主要原因之一，但其确切机制尚不十分清楚。

Tab.2 OD of ChAT in prefrontal cortex and hippocampus(，n=5)

Tab.2 OD of ChAT in prefrontal cortex and hippocampus(，n=5)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CIH 1week group

Group OD of ChAT Prefrontal cortex Hippocampus Control 0.445±0.131 0.266±0.035 CIH1w 0.343±0.069 0.254±0.037 CIH3w 0.296±0.075* 0.191±0.038*#CIH5w 0.222±0.049*# 0.182±0.029*#

在机体所有器官中，中枢神经系统对低氧最为敏感，低氧可引起学习、记忆、行为和情绪等高级功能障碍。本研究利用Morris水迷宫实验分别对CIH1周、CIH3周和CIH5周三组大鼠认知功能变化进行评价，以探讨大鼠认知行为随CIH时间长短的变化规律。Morris水迷宫是检测大鼠学习记忆(尤其是空间记忆)功能的较为可靠的方法。通过定位航行实验测定大鼠的学习能力，逃避潜伏期越短，学习能力越强;空间搜索实验检测大鼠记忆能力，平台所在象限游泳时间占整个游泳时间百分比值越大，说明大鼠空间记忆能力越强。本实验结果显示，各组前4个训练日逃避潜伏期随时间变化逐渐缩短，第5个训练日开始成绩趋于稳定，提示各组大鼠都具有一定的空间学习能力。随低氧时间延长，CIH各组逃避潜伏期逐渐延长，空间探索时原有平台所在象限停留时间百分比逐渐减少，与对照组比较，仅CIH5w组大鼠差异具有显著性，提示随着低氧的进行，大鼠空间学习记忆能力进行性下降，但CIH要持续进行一定时间后才会出现明显的学习记忆功能障碍。

中枢神经系统存在着许多与学习记忆有关的神经结构，其中海马和前额叶皮层与空间认知功能关系密切。海马是学习记忆的重要部位，海马神经元结构和功能的完整性是维持学习记忆的前提。前额叶皮层与海马在解剖学上有密切的联系，海马接受前额叶皮层的传入纤维，又通过传出纤维投射至前额叶皮层，因此，前额叶皮层在认知过程中也扮演了十分重要的角色。有研究表明，大脑皮层和海马对低氧具有易感性，海马CA1、CA3区对低氧尤为敏感，会导致神经元出现不同程度的低氧性损伤改变。本实验通过对前额叶皮层和海马CA1、CA3、齿状回坏死神经元计数也发现，CIH各组前额叶皮层和海马神经元细胞形态变化较大，与对照组比较，CIH各组前额叶皮层和海马坏死神经元数量增多，并且随着低氧时间延长，坏死神经元数量呈进行性增多趋势，CIH各时间组间也存在显著差异，说明低氧不仅使前额叶皮层、海马神经元结构遭受破坏，神经元变性坏死，而且这种病理性损伤随着低氧的进行呈慢性进行性加重趋势。CIH过程中，大鼠学习记忆能力进行性下降可能与前额叶皮层、海马病理性损伤慢性进行性加重有关。

ChAT是与学习记忆最相关的神经递质乙酰胆碱合成过程中的限速酶，ChAT的生物活性和含量对乙酰胆碱促进学习记忆的神经生物学功能的正常发挥起着十分重要的作用。因此，ChAT在相关脑区含量的高低与学习记忆功能密切相关。本实验中观察到，与对照组比较，CIH各组大鼠前额叶皮层和海马ChAT阳性表达减少，并且随着低氧时间延长，CIH大鼠前额叶皮层和海马ChAT阳性表达呈进行性减少趋势。这一结果说明CIH不仅使前额叶皮层、海马ChAT含量减少，而且这种改变随低氧的进行呈慢性进行性加重趋势。CIH过程中，大鼠学习记忆能力进行性下降可能与前额叶皮层、海马ChAT含量慢性进行性降低有关。国内外在对各种脑损伤模型的研究中发现，脑损伤后可造成ChAT活性降低，并认为这可能与脑损伤后的认知缺失有关。如:Ricceri L[6]和田金洲[7]等就分别观察到药物性和缺血性脑损害时，大鼠出现认知功能障碍，同时伴有海马和/或大脑皮质的ChAT活性降低，认为ChAT活性降低可能是学习记忆障碍的神经生物学基础。然而引起研究者注意的是，与对照组比较CIH3w组大鼠并未出现明显的认知功能障碍，而其在前额叶皮层和海马ChAT阳性表达减少却与对照组有明显差异，研究者认为这可能表明在CIH导致认知功能障碍出现之前，胆碱能神经元的损害就已经发生了，这一结果提示单纯的胆碱能神经元受损似乎还不足以完全导致认知功能障碍，认知功能究竟是在哪些系统的参与下，通过何种机制来完成还有待于进一步研究。

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[2]Gotti C，Clementi F.Neuronal nicotinic receptors:from structure to pathol[J].Prog Neurobiol，2004，74(6):363-396.

[3]薛全福，谢剑鸣，胡长贵，等.常压缺氧性大鼠肺动脉高压模型的建立[J].中华结核和呼吸杂志，1989，12(6):350-351.

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