多巴胺D3受体对大鼠肾脏近曲小管上皮细胞多巴胺D4受体表达和功能的影响*

陈新建，杨剑，任红梅，陈彩宇，何多芬，王旭开，王红勇，杨成明，周林，曾春雨

肾脏是人体负责尿钠排泄的重要器官，它通过对尿钠重吸收的调节在血压调节中发挥重要的作用，其中多巴胺及其受体的作用尤为重要［1］。多巴胺受体按其结构和药理特性不同分为两大类，即D1类受体(D1、D5)和 D2类受体(D2、D3、D4)，所有多巴胺受体都直接或间接参与肾脏的尿钠排泄和血压的调控［2］。D3、D4受体均为D2类受体，对肾脏尿钠排泄及机体血压调控发挥重要作用。我们前期研究表明多巴胺受体亚型之间具有相互作用:刺激Wistar-Kyoto(WKY)大鼠肾脏近曲小管(RPT)上皮细胞的D3受体能够影响D1、D5受体表达及其介导的生理功能［3，4］。但是，D3受体对同为多巴胺D2类受体的D4受体是否具有作用目前还不清楚。本实验利用WKY大鼠的RPT上皮细胞株为研究对象，观察D3受体激动剂作用后对D4受体表达与功能的影响。

1 材料与方法

材料:RPT细胞株于2003-06由美国Georetown大学Dr.Pedro.Jose实验室提供，来源于4～8周的WKY大鼠，既往实验证实其与活体 RPT具有相同的特性［5，6］;胎牛血清与 DMEM/F12 培养基购至美国 Gibco公司;D3受体激动剂(PDl28907)、D3受体特异性抑制剂(U99194A)，D4受体激动剂(PD168077)、磷脂酶C抑制剂(U73122)均购自美国Sigma公司;D4受体抗体为羊抗多克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司。

细胞培养:RPT上皮细胞在含有95%空气和5%二氧化碳的培养箱培养，所用培养基为DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)。待细胞长至80% ～90%融合状态用0.25%胰酶消化、传代。

免疫印迹:药物干预后的细胞经过常规方法提取蛋白，测定蛋白浓度。等量总蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干转移法将蛋白转移至聚偏(二)氟乙烯膜上，室温封闭4 h，然后与D4受体抗体(稀释浓度为1∶400)作用，4℃孵育过夜，二抗(稀释浓度为1∶5000)室温孵育1 h，采用Super Signal(美国Pierce公司)显色发光。免疫印迹结果用α-肌动蛋白(α-actin)进行校正。

细胞膜的制备:将所选细胞用D3受体激动剂PDl28907刺激24 h后，洗去D3受体激动剂PDl28907，再用10－7mol/L D4受体激动剂PD168077刺激细胞15 min，测定D4受体激动剂PD168077对RPT上皮细胞的Na+-K+-ATP酶(ATP为三磷酸腺苷)活性的影响(与单独D4受体激动剂PD168077作用相比)。细胞膜悬液采用等渗、低温高速离心法进行制备。

Na+-K+-ATP酶活性测定:酶活性测定采用哇巴因法，钼酸铵硫酸亚铁显色定磷后，740 nm处比色，用分光光度法测定产生的无机磷含量，其中无哇巴因存在下产生的无机磷为总ATP酶活性，有哇巴因存在下产生的为Mg+-ATP酶，两者之差为Na+-K+-ATP酶活性。其中，以对照活性为100%。

统计学方法:计量资料以平均数士标准差表示，两组以上的比较采用ANOVA法进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D3受体激动剂PDl28907对Wistar-Kyoto大鼠肾脏近曲小管上皮细胞D4受体表达的影响

利用不同浓度D3受体激动剂PD128907(10－10～10－6mol/L)作用RPT上皮细胞24 h，结果发现D3受体激动剂PD128907能够有效增强RPT上皮细胞中D4受体蛋白表达，该作用呈现浓度依赖性关系，10－9～10－6mol/L与对照(不加任何药)比差异均有统计学意义(P＜0.05)。(图1)

利用D3受体激动剂PD128907(10－7mol/L)分别刺激 RPT 上皮细胞不同时间(4 h、8 h、16 h、24 h、30 h)，结果发现D3受体激动剂PD128907对RPT上皮细胞中D4受体蛋白表达的影响也呈现时间依赖性关系，4 h、8 h、16 h、24 h、30 h 与对照(0 h)比差异均有统计学意义(P＜0.05)。(图2)

预先用D3受体抑制剂U99194 A(10－6mol/L)共刺激作用下，发现 D3受体激动剂 PD128907(10－7mol/L)对D4受体蛋白表达的促进作用受到阻断，单独的D3受体抑制剂U99194 A对D4受体蛋白表达与对照(不加任何药)比没有变化。单独的D3受体激动剂PD128907(10－7mol/L)对D4受体蛋白表达均高于对照(不加任何药)、单独U99194 A及PD128907+U99194 A，差异均有统计学意义(P＜0.05)。(图3)

利用磷脂酶C抑制剂U73122(10－7mol/L)预先孵育细胞，再与D3受体激动剂PD128907(10－7mol/L)单独或共刺激RPT上皮细胞。结果发现在磷脂酶C抑制剂 U73122存在的情况下，D3受体激动剂PD128907刺激D3受体后对D4受体的促进表达效应受到显著抑制。单独的 D3受体激动剂 PD128907(10－7mol/L)对D4受体蛋白表达均高于对照(不加任何药)、单独U73122及PD128907+U73122，差异均有统计学意义(P＜0.05)。(图4)

图1 不同浓度D3受体激动剂PDl28907(10－10～10－6mol/L)对D4受体蛋白表达的影响。与对照比*P＜0.05，n=5

图2 D3受体激动剂PDl28907(10－7mol/L)不同作用时间对D4受体蛋白表达的影响。与对照比*P＜0.05，n=5

图3 被D3受体抑制剂U99194A刺激后，D3受体激动剂PD128907(10－7mol/L)对D4受体蛋白表达的影响。与其它3项比*P ＜0.05，n=8

图4 被磷脂酶C抑制剂(U73122，10－7mol/L)刺激后，D3受体激动剂PD128907(10－7mol/L)对D4受体蛋白的影响。与其它3项比*P＜0.05，n=8

2.2 D3受体激动剂PD168077对肾脏近曲小管上皮细胞中D4受体介导的Na+-K+-ATP酶活性抑制功能的影响

单独的D4受体激动剂PD168077刺激细胞15 min后，Na+-K+-ATP酶的活性为77%，与对照100%比较明显受到抑制(P＜0.05，n=5);利用D3受体激动剂PD128907(10－7mol/L)刺激24小时后，再用D4受体激动剂PD168077刺激D4受体，则使得Na+-K+-ATP酶活性进一步降低为62%，与对照100%比较差异有统计学意义(P ＜0.05，n=5)。

3 讨论

肾脏是人体负责尿钠排泄的主要器官，它通过对尿钠重吸收的调控作用在血压调节中发挥重要的作用，其中多巴胺及其受体的作用尤为重要。RPT是多巴胺分泌的部位，也是主要的作用部位，当体内钠负荷过载时，多巴胺通过抑制RPT对尿钠的重吸收，在肾脏尿钠排泄中发挥重要作用［7，8］。多巴胺受体根据结构和药理学特性不同分为D1类(D1和D5)受体和D2类(D2，D3，D4)受体［9］。以往研究大多集中于多巴胺D1类受体，对多巴胺D2类受体研究较少。不过，近年来的研究表明，属于多巴胺D2类受体的多巴胺D3与D4受体在肾脏尿钠排泄中均具有重要作用。

D3受体与D4受体均为多巴胺D2类受体中的亚型之一，在肾脏中的近曲小管、远曲小管、皮质集合管、肾小球以及肾脏血管等均有表达，这两种多巴胺受体亚型均对肾脏尿钠排泄具有促进作用［10，11］。研究发现D3受体突变小鼠(D3-/-)与 D4受体突变小鼠(D4-/-)的血压也均明显高于野生型小鼠［12，13］。同时，我们前期研究也发现了在WKY大鼠肾脏中，刺激D3受体可明显增加D3/Ga12受体及D3/Ga13受体之间的连接程度，这将有利于肾脏尿钠排泄［14］;在WKY的RPT细胞中，刺激D3受体可显著抑制血管紧张素1型受体(AT1受体)的表达，这也有利于抑制血管紧张素1型受体介导的尿钠潴留作用［15］。既往研究发现，在多巴胺D1类和D3类受体之间存在协同作用，刺激RPT细胞的D3受体能够影响D1、D5受体表达及其介导的生理功能［3，4］。但是，同属于多巴胺D2类受体的D3受体与D4受体是否也具有相互作用并不清楚。我们在本研究中发现，利用D3受体激动剂PD128907作用于WKY大鼠的RPT上皮细胞可以显著促进D4受体的表达，提示D3受体可能通过影响D4受体的表达从而影响D4受体介导的生理学功能。

在以往研究中，我们已经发现 D4受体激动剂PD168077作用WKY的RPT细胞后，可以明显抑制RPT细胞的Na+-K+-ATP酶活性，从而抑制肾小管尿钠重吸收，有利于肾脏尿钠排泄［10］。因此，我们在发现D3受体增强D4受体的表达后继续研究了该效应是否影响了D4受体介导的尿钠排泄功能。结果发现，相对于单独刺激D4受体的作用而言，在D3受体预先刺激24小时的情况下，D4受体激动剂PD168077对RPT上皮细胞的Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用有所增强，提示D3受体对D4受体介导的对Na+-K+-ATP酶活性的抑制效应同样具有促进作用。这进一步说明D3受体在RPT可以通过改变D4受体表达，进而对D4受体功能产生影响，从而改变D4受体介导的促尿钠排泄功能。

研究发现磷脂酶C在多巴胺受体介导的多个信号途径中发挥了重要作用。多巴胺D1类受体激动剂在哺乳动物脑部可以通过磷脂酶C信号从而在磷酸肌醇信号途径中发挥作用［16］。多巴胺D1与D2受体共刺激后可以通过磷脂酶C途径及其下游钙离子信号通路从而在受体功能上发生相互关联［17］。因此，我们推测D3受体很可能也通过磷脂酶C信号途径增强D4受体的表达及其介导的生理功能。我们预先使用磷脂酶C抑制剂U73122作用RPT上皮细胞后，发现D3受体激动剂PD128907促进D4受体表达的效应作用受到明显抑制，提示在WKY的RPT上皮细胞中D3受体对D4受体的增强作用可能与磷脂酶C信号途径有关。

综上所述，刺激D3受体可以促进D4受体表达及其介导的促尿钠排泄功能而发挥对血压的调控作用，该作用可能通过磷脂酶C信号途径完成。

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