AQC柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中游离氨基酸

王亚超，曹 玲，王 玉，

(1.中国药科大学，江苏 南京 210009;2.江苏省食品药品检验所，江苏 南京 210008)

猴头菌[Hericium erinaceus(Rull ex F.)Pers.]又名猴头菇、剌菌或猬菌，是最早加工成中成药的药用菌之一，因用子实体作原料成本较高，生产中多用固体培养的菌丝体代替子实体作原料。胃乐宁片系猴头菌丝体加工制成，被列为“中药保护品种”目录，具有养阴和胃功效，用于胃、十二指肠溃疡和慢性萎缩性胃炎等症。和多数药用真菌一样，猴头菌丝体中含有丰富的氨基酸成分，不同种类的氨基酸功效各异，对人体具有十分重要的生理作用[1]，2010年版中国药典[2]加强了对真菌类药物中氨基酸成分的质量控制。曾有文献报道过猴头菌中氨基酸的测定[3-4]，但主要是测定其中的水解氨基酸，操作复杂，适用性差，对游离氨基酸的研究未见报道。

本实验建立了一种柱前衍生高效液相色谱法，对包括天门冬酰胺和谷氨酰胺在内的21种常见氨基酸进行定量测定。

1 仪器和试药

Agilent 1100 series高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器;JL-720 DT型超声清洗器，上海杰理科技有限公司;EYELA真空旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司。

胃乐宁片由南京市老山药业股份有限公司提供;21种对照品[天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、胱氨酸(Cys2)和 γ-氨基丁酸(GABA)]，中国药品生物制品检定所;内标α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)，美国Sigma公司;AccQ·Fluor氨基酸衍生试剂盒，美国Waters公司。乙腈为色谱纯;实验用水为去离子超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相 A:0.14 mol/L 醋酸铵缓冲液(用冰醋酸调 pH 5.10)，流动相 B:乙腈-水(57∶43);柱温 30℃，检测波长 248 nm，进样量5 μL。按表1进行梯度洗脱。结果表明在此色谱条件下21种氨基酸可以获得良好分离，分离结果见图1。

表1 梯度洗脱表Tab.1 The gradient elution

图1 21种混合氨基酸对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of 21 amino acid standards(A)and sample(B)

2.2 试液制备

2.2.1 衍生化试剂制备 精密量取AccQ·Fluor 2B试剂1 mL，加入含衍生化试剂的AccQ·Fluor 2A瓶中，加盖密封，旋涡混合10 s，55℃加热10 min，直至衍生化试剂粉末全部溶解，即得浓度10 mmol/L的AccQ·Fluor衍生化试剂，置干燥器中保存备用。

2.2.2 标准品储备液和内标液的制备 混合储备液:分别取 18 种氨基酸(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Arg、Ala、Pro、Tyr、Cys2、Val、Met、Ile、Leu、Lys、Phe 和GABA)适量，精密称定，置于同一50 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，制成浓度均约为5 mmol/L(胱氨酸的浓度约为2.5 mmol/L)的标准储备液，置4℃保存备用。Gln、Asn和Trp标准储备液临用前单独配制，浓度均约为5 mmol/L。

内标液:取α-氨基丁酸约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，混匀。

2.3 供试品制备及衍生化反应

取本品30片，除去包衣，精密称定，研细混匀，取粉末0.5 g，精密称定，加60%乙醇30 mL，超声(功率250 W，频率100 kHz)提取30 min，离心，残渣用60%乙醇25 mL同法重复提取一次，残渣连同滤纸用60%乙醇洗涤3次，每次3 mL，合并提取液和洗涤液，旋转浓缩至干，转移至10 mL量瓶中，精密加入内标液200 μL，稀释至刻度。用0.45 μm 滤膜滤过，精密吸取续滤液10 μL，置小试管中，精密加入硼酸盐缓冲液70 μL，涡旋混匀，立即精密加入衍生化试剂20 μL，涡旋反应30 s，即得。

2.4 线性关系和最低检测限

分别取混合标准储备液和Gln、Asn、Trp标准液适量，加入内标液适量，制成各种氨基酸浓度均约为0.01，0.02，0.05，0.10，0.25，0.50 mmol/L 的混合标准溶液。分别精密吸取10 μL，置小试管中，精密加入硼酸盐缓冲液70 μL，涡旋混匀，立即精密加入衍生化试剂 20 μL，涡旋反应 30 s，分别取 5 μL，注入色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定。以各种氨基酸峰面积与内标峰面积之比为纵坐标y，各氨基酸浓度(mmol/L)为横坐标x，线性回归得到的线性方程见表2。结果表明，21种氨基酸在0.5～0.01 mmol/L范围内与峰面积比具有良好的线性关系。将0.01 mmol/L混合标准溶液液逐步稀释后衍生化反应，量取5 μL注入色谱仪，以S/N=3确定最低检测限，得到21种氨基酸的检出限，见表2。

2.5 精密度试验、重复性及稳定性试验

取加入标样的供试品溶液，进行衍生化反应和色谱分析，平行进样 5 次，并分别在 0，2，4，8，12 和24 h进样，根据各氨基酸色谱峰面积与内标峰面积比值，计算RSD，以考察其精密度和稳定性，21种氨基酸的精密度试验 RSD在0.41% ～2.48%(n=5)，稳定性试验 RSD 在 0.11% ～2.32%(n=5)。另取同一批胃乐宁片粉末6份，按2.3项方法进行提取、衍生化反应和色谱分析，根据各种氨基酸的色谱峰面积与内标峰面积比值，计算RSD，以考察方法的重复性，21种氨基酸峰重复性试验RSD在0.65%～3.26%(n=6)。

2.6 回收率试验

取已知含量的供试品粉末约0.25 g，平行6份，精密称定，分别精密加入各氨基酸储备液100 μL，分别进行提取、衍生化反应和色谱分析，计算各种氨基酸的加样回收率和RSD。结果见表2，平均回收率在91.5% ～107.0%，RSD 在 0.63% ～3.79%。

表2 21种氨基酸的线性方程、检测限与回收率(n=6)Tab.2 Regression equations，LOD and recoveries of 21 amino acids(n=6)

表3 供试品测定结果Tab.3 Results of sample determination

2.7 供试品测定结果

取供试品两份，按2.3项下制备方法进行提取、衍生化反应，分别取5 μL，注入色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，结果见表3。

3 讨论

样品测定结果显示，各批次样品中的游离氨基酸均以Arg含量最高，占游离氨基酸总量的20%以上，Ala含量次之，其中 His、Cys2、Met和 Gln 由于含量低于检测限而未能检出，不同批次的样品之间各种氨基酸的含量具有一定的差异，可以为深入开展其质量研究提供依据。

据报道[5-7]，目前提取游离氨基酸的提取溶剂主要有水、乙醇水溶液等。本试验分别考察了水、40%，50%，60%和70%乙醇等5种提取溶剂经超声提取情况，结果显示，水提取物中含有的水溶性蛋白给浓缩等后续样品处理以及衍生化反应和色谱分析等过程均造成了干扰，提取溶剂中加入乙醇可消除干扰，且随着乙醇浓度的增加提取的氨基酸的含量也略有增加，但乙醇浓度增至70%时反而有所下降，可能是乙醇浓度过高不利于极性氨基酸如Arg的提取，故选择60%乙醇溶液作为提取溶剂。

酰胺类氨基酸的检测历来是分析的难点[8]，本法在Waters公司的AQC衍生化氨基酸分析方法的基础上进行改进，只需精确控制缓冲液的pH值即可。在色谱分离过程中有三个关键色谱峰对，其中Glu/Asn峰对对pH变化很敏感，当pH值由5.00变为5.10时，Glu/Asn峰对由相互重叠逐渐达到完全分离，而His/Gly和NH3/Ala峰对的分离略微受到影响;同时NH3/Ala峰对对有机相比例变化较敏感，通过试验将有机相组成确定乙腈-水(57∶43)。这三组峰对的保留时间均比较小，进样后可先以较小流速洗脱再增加流速，以进一步改善分离效果，使三组峰对均能达到基线分离。

[1]王晓玉，蒋秋燕，凌沛学，等.猴头菌活性成分及药理作用研究进展[J].中国生化药物杂志，2010，31(1):70-72.

[2]中国药典[S].一部.2010:681-682.

[3]胡小加，周宏斌，周平贞.猴头菌及猴头酒营养成分分析[J].食品科学，1992，12:47-48.

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