大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究

王利锋，李学英，王大忠，2

(1.遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州 遵义 563003;2.铜仁学院，贵州 铜仁 554300)

两栖类皮肤湿润、裸露，无疑给外界微生物的侵入提供了便利条件，为了自身生存和适应栖息地多样化生态环境的需要，它们依靠皮肤腺体分泌出一系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵袭[1]。相关研究结果显示，两栖类皮肤抗菌肽呈现出超乎想象的分子和功能的多样性[2-3]。国内外对于两栖类皮肤抗菌肽的研究主要集中在无尾目两栖类，例如最广泛分布的蛙科(Ranidae)，它们皮肤抗菌肽在种类和数量等方面，都是极其惊人的[4]。而对于有尾目两栖类，除红瘰疣螈[5](Tylototriton verrucosus)和山溪鲵[6](Batrachuperus)外，目前尚未见文献报道其皮肤分泌液存在抗菌活性物质。

大鲵(Megalobatrachus japonicus daridianus Blanchard)属大型两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是我国二级保护动物，有活化石之称。人们在欧洲、东亚和北美地区发现的大约距今300万至7000万年的大鲵化石暗示其在地球上曾广泛分布[7]。

目前我国大鲵的人工养殖已经实现产业化，为从大鲵皮肤分泌液中提取抗菌肽提供了丰富的资源。作为现存个体最大的两栖类动物，其皮肤腺发达，在试验中观察到大鲵皮肤在受到理化刺激时能分泌大量白色状黏液，最初呈白浆状，后渐变为黏稠胶状物，具浓涩气味。本实验对大鲵皮肤分泌液中是否含有抗菌活性物质进行了检测，并鉴定其部分性质，为进一步的研究工作奠定基础。

1 材料

1.1 动物和菌种

成年大鲵雌雄各一尾，购于贵州锦江娃娃鱼有限公司。

菌种:大肠埃希菌(Escherichia coli)No.ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)No.ATCC 29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)No.ATCC 35984、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)No.ATCC 27853、白色念珠菌(canidia Albicans)No.ATCC 10213、溶血性链球菌(Hemolytic streptococcus)No.CMCC(B)32264，遵义医学院微生物学教研室保藏。

1.2 试剂

葡聚糖凝胶SephadexG-50和SephadexG-25，GE Healthcare公司;低相对分子质量(Mr)标准蛋白，北京经科宏达生物技术有限公司;TEMED、Tris、Tricine、丙烯酰胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250，美国Sigma公司;BCA法蛋白定量试剂盒，上海碧云天生物公司;营养肉汤培养基、MH(A)培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。

2 方法

2.1 皮肤分泌液的粗提

采用电刺激法诱导大鲵皮肤分泌黏液。按体积比1∶1将收集到的皮肤分泌液用5%乙酸浸提，4℃下搅拌24 h。12000 r/min离心30 min取上清，用磷酸盐缓冲液调pH至7.2，12000 r/min离心30 min，取上清冷冻干燥，

2.2 抗菌肽分离纯化

粗提物用注射用水溶解，截留Mr10000的超滤膜4℃下超滤分离，收集Mr大于10000和小于10000两部分溶液，抑菌圈法[7]筛选有抗菌活性的溶液，经 0.45 μm 膜过滤后，Sephadex G-50 凝胶色谱(1.6 cm ×60 cm)分离，用0.05 mol/L 的Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)平衡色谱柱，样品上样后用同样的缓冲液洗脱，流速为2.0 mL/8 min，每8 min收集1管，测定A280nm，绘制洗脱曲线，收集各峰。同样方法筛选具有较强抗菌活性的峰，冷冻干燥浓缩样品至4.5 mL，再采用相同方法，进行Sephadex G-25凝胶色谱(1.6 cm×60 cm)分离，得到具有抗菌活性的溶液浓缩后4℃保存。

2.3 蛋白质含量检测

BCA法蛋白定量试剂盒检测抗菌肽溶液的蛋白质含量，按试剂盒说明书操作。

2.4 电泳鉴定

2.4.1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳 分离胶、夹层胶、浓缩胶分别为16.5%，10%和4%的丙烯酰胺凝胶，厚度为0.75 mm，3 种胶长度比例为 4∶1.5∶1，阳极缓冲液为0.2 mol/L Tris缓冲液(pH 8.9)，阴极缓冲液为 0.1 mol/L Tris(内含 0.1 mol/L Tricine，0.1%SDS，pH 8.25)溶液。每孔上样量 15 μL，30 V恒压电泳约30 min，当样品进入分离胶时，电压升至100 V约3 h。

2.4.2 等电聚焦电泳 按《中国药典》三部(2005版)方法进行，不同之处在于配制凝胶时加入尿素，使最终的电泳胶含33%的尿素。

2.5 抗菌活性检测

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌培养基为MH(A)培养基;溶血性链球菌的培养基为在MH(A)培养基中加入10%的脱纤维羊血;白色念珠菌培养基为沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(SDA)。采用抑菌圈法，中央孔加入注射用水作为阴性对照，其中一孔加入相应抗生素为阳性对照，37℃恒温培养18 h(白色念珠菌28℃恒温培养2 d)，观察抑菌圈大小。抑菌圈10 mm作为样品最小抑菌浓度的检测标准。

2.6 溶血活性检测

微量溶血试验评估溶血活性。取健康人血液用生理盐水洗涤红细胞至上清无色，3000 r/min离心1～2 min，弃上清，用生理盐水配成2%红细胞悬液，将抗菌肽溶液用生理盐水稀释成500，100，50，40，30，20，10 μg/mL 的溶液，加入等体积的 2% 红细胞悬液，阳性对照为0.1%TritonX-100，阴性对照为生理盐水，每个样品设3个平行孔，37℃孵育1 h，离心去掉完整的红细胞。取上清，540 nm波长处测定各管的吸光度值。

2.7 稳定性实验

2.7.1 热稳定性实验 100 μg/mL抗菌肽溶液分别在 40，50，60，70，80，90，100，121 ℃ 下处理 10 min，冰浴冷却，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，未处理抗菌肽溶液为对照，测定其抑菌圈直径，每个处理样品重复试验3次，根据抑菌圈直径大小确定其热稳定性。

2.7.2 酸碱稳定性实验 100 μg/mL抗菌肽溶液用0.1 mol/L HCl溶液或 0.1 mol/L NaOH 溶液调整样品pH 2.5～10.0;室温放置2 h，用磷酸盐缓冲液将样品pH值复调至7.2，未经处理的抗菌肽溶液为对照，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，每个处理样品重复试验3次，根据抑菌圈直径大小确定其酸碱稳定性。

3 结果

3.1 大鲵皮肤分泌物中抗菌肽的分离纯化

超滤液抗菌活性检测，Mr小于10000的溶液具有明显的抗菌活性。

Sephadex G-50柱色谱分离，得到2个明显的主峰(图1)。抗菌试验表明，第2个主峰36～89管收集液有明显的抗菌活性。Sephadex G-25柱色谱分离，得到3个明显的峰(图2)。抗菌试验表明，第2个峰11～40管收集液有明显的抗菌活性。

图1 Sephadex G-50凝胶过滤色谱结果Fig.1 The result of gel chromatography by Sephadex G-50

图2 Sephadex G-25凝胶过滤色谱结果Fig.2 The result of gel chromatography by Sephadex G-25

3.2 蛋白质含量检测

线性回归方程为:A=0.344 C+0.145，r=0.997，根据回归方程计算出抗菌肽溶液蛋白质含量为 0.95 mg/mL。

3.3 电泳鉴定结果

经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定大鲵皮肤分泌液的粗提物中蛋白条带多，Sephadex G-50分离后有3条蛋白条带，Sephadex G-25分离后呈单一蛋白条带，其Mr约为4300(图3);Sephadex G-25分离后的样品经等电聚焦电泳鉴定蛋白条带存在于pH梯度(pH 3～10)电泳中的偏碱性区域，表现出较强的阳离子特征。

图3 Tricine-SDS-PAGE电泳Fig.3 Electrophoresis in Tricine-SDS-PAGE

3.4 抗菌活性检测

抗菌肽溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血性链球菌和白色念珠菌均有较强的抗菌活性，最小有效抑菌浓度分别为12，16，16，22，16，18 μg/mL。

3.5 溶血性检测

血平板检测结果未见溶血现象。说明不同浓度的大鲵皮肤分泌液中抗菌肽溶液对人血红细胞没有溶血作用。

3.6 稳定性试验

3.6.1 热稳定性试验 结果见图4。大鲵皮肤分泌液中抗菌肽对温度有较好的耐受性，样品在20～40℃抗菌活性没有变化，100℃煮沸10 min还有抗菌活性，121℃保持10 min后无抗菌活性。

图4 不同温度处理后的抗菌肽抗菌活性Fig.4 Effect of the extracts from the skin secretions of the Andrias davidianus at different temperature against staphylococcus aureus

3.6.2 酸碱稳定性试验 结果见图5。大鲵皮肤分泌物中抗菌肽在pH 5.0～8.0时抗菌活性稳定，在pH 3.0以下，pH 9.0以上活性丧失。

图5 不同pH处理后抗菌肽的抗菌活性Fig.5 Effect of acid and alkali on antagonistic impact of the extracts from the skin secretions of the Andrias davidianus

4 讨论

两栖类皮肤抗菌肽是先天性防御系统的重要组成部分，具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点[8-9]，在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天，这类皮肤抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物[10]。

本研究首次从大鲵皮肤分泌液中分离纯化出一种具有抗菌活性的小分子多肽。研究结果表明，大鲵皮肤分泌液中含有抗菌活性物质，这种抗菌活性物质对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌均具有较强的抗菌活性，并且随着浓度的升高其抗菌活性增强;同时它还具有较强的耐高温的特性，对较高或较低的pH均具有较强的耐受性，在pH 5.0～8.0的时候抗菌效果最为明显;不同浓度的溶液对人血红细胞没有溶血作用;Tricine-SDS-PAGE电泳图谱可见单一的条带，其Mr约为4300，等点聚焦电泳检测显示该小分子多肽具有较强的碱性，此抗菌肽也可能是一个具有较强阳离子特征的碱性肽。这与近年报道的两栖类动物皮肤分泌物中抗菌肽相似。因此，本研究结果提示从大鲵皮肤分泌物中得到的抗菌活性成分是一种抗菌肽。

抗菌肽的抗菌机制目前公认的是抗菌肽与细胞膜的作用，是通过分子聚集在细菌细胞膜内外形成离子通道，导致膜去极化，使得细胞膜不能维持正常的渗透压，导致细胞内容物大量外流，最后细胞停止生长或发生死亡，即所谓通道理论[11]。正电荷在这种抗菌机制中起到了关键作用，这些阳离子抗菌肽通过与细菌细胞质膜磷脂分子上的负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上。然后抗菌肽分子的疏水端借助水分子中连接结构的柔性，插入质膜中，这样就打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，最终通过膜内分子间的相互移位，使抗菌肽分子相互聚集在一起，形成离子性通道，导致细菌失去膜势，不能保持正常的渗透压而死亡[12]。Issacson 等[9]发现蛙皮抗菌肽Temporin-1Ja(ILPLVGNLLNDLL-NH2)几乎不表现抗菌活性，与Temporin-1族其它抗菌肽分子对比发现，Temporin-1Ja由于第11位的赖氨酸残基被天冬氨酸残基取代成为阴离子肽。Lai等[13]发现从大蹼铃蟾cDNA库中筛选到的阴离子抗菌肽maximin H5(ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2)仅具备有限的抗菌活性。本实验从大鲵皮肤分泌液中得到的抗菌肽，通过等点聚焦电泳检测显示出较强的阳离子特征，该小分子肽也是一个碱性肽，我们推测其抗菌机制也可能是通过细胞膜而发挥作用的。

目前，虽然从大鲵皮肤分泌液中纯化得到了一种抗菌肽，但仍有许多问题需要阐明，如大鲵皮肤分泌物中是否还存在其它一些活性肽(广谱性的和抗细菌的)以及它们的结构和功能等方面都需要做进一步研究，以获得将大鲵皮肤分泌液中抗菌肽开发为新一代抗感染药物所必须了解的信息。

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