毛蚶多肽提取物的体外免疫活性

黄演君，宋丽艳，于荣敏

(暨南大学 药学院 1.天然药物化学教研室;2.药理学教研室，广东 广州 510632)

毛蚶(Arca subcrenata Lischke)，软体动物门，瓣鳃纲，蚶目，蚶科，毛蚶属，主要分布于中国、朝鲜和日本沿海[1]。毛蚶的营养与药用价值较高，其壳和肉皆有药用价值。中医认为其性温味甘，归脾、肝经，具温中健胃、滋阴补血之功效，临床上主治贫血、体虚等[2]。目前对毛蚶活性成分的研究多为毛蚶多糖、多肽这两类大分子物质。何赟绵等[3]从毛蚶中分离到一种多糖精品，并发现其能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖;王莉等[4]报道了毛蚶多糖对正常小鼠免疫功能具有调节作用;在本研究组的前期研究中，发现毛蚶多肽提取物(PEAS)在体外能够显著抑制多株肿瘤细胞的增殖[5-6]，但目前尚未见对PEAS免疫活性的文献报道。为了进一步研究PEAS的生物学活性，为其更合理的开发和利用奠定基础，本文通过考察PEAS体外对正常小鼠免疫细胞功能的影响，初步探讨其免疫调节作用机制。

1 材料

毛蚶购于广州市黄沙海产品市场，经暨南大学药学院于荣敏教授鉴定为毛蚶。新鲜毛蚶去壳，经匀浆、离心、透析、冻干后制得PEAS，经Lowry法检测其蛋白含量为76.3%。

小鼠淋巴瘤细胞株YAC-1购于中山大学实验动物中心子细胞库。

RPMI 1640培养液，美国Hyclone公司;链霉素、青霉素、四甲基偶氮唑盐(MTT)，Genview公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;台盼蓝(Trypan Blue)、细菌脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(Con A)、碘化丙啶(PI)，美国Sigma公司;小鼠干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、双抗夹心 ELISA 检测试剂盒，武汉华美生物工程有限公司。

SPF级昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g，广东省医学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(粤)2008-0002。普通洁净环境下饲养，温度18～24℃，动物可以自由摄食和饮水。

680型酶标仪，美国Bio-RAD公司;6500TC二氧化碳培养箱，美国NAPCO公司;CR21G型冷冻离心机，日本日立公司;EPICSXL-MCL型流式细胞仪，美国Backman-Coulter公司。

2 方法

2.1 PEAS对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响

颈椎脱臼法处死小鼠，用75%酒精浸泡约3 min消毒，剪开皮肤暴露腹膜，剪开腹膜无菌取脾并置于无血清的RPMI 1640培养液中，冲洗2次，用注射器取无血清RPMI 1640培养液约5 mL，轻轻插入脾内吹出细胞，重复操作数次至脾外膜透明，余下脾脏用注射器研磨并过200目筛。收集全部细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入Tris-NH4Cl溶液约3 mL轻轻吹匀，去除红细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，重复操作2次。细胞沉淀用无血清RPMI 1640培养液重悬，轻轻吹匀，1000 r/min离心5 min，弃上清。细胞沉淀用RPMI 1640完全培养液重悬，台盼蓝染色计数活细胞95%以上。

取脾淋巴细胞悬液，调整细胞密度为5×106个/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100 μL。分为3组:PEAS单药组、PEAS+Con A组和PEAS+LPS组。PEAS单药组每孔分别加入含不同浓度PEAS的RPMI 1640完全培养液100 μL，使PEAS的终浓度分别为 15.62，31.25，62.5，125，250 和 500 μg/mL，并设阴性对照组(加RPMI 1640完全培养液100 μL);PEAS+Con A组每孔 PEAS终浓度同PEAS单药组，每空另加入Con A，终浓度为5 μg/mL，并设阴性对照组(加10 μg/mL Con A的RPMI 1640完全培养液100 μL);PEAS+LPS组每孔PEAS终浓度同 PEAS单药组，每空另加入LPS，终浓度为 20 μg/mL，并设阴性对照组(加 40 μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养液100 μL)。各浓度组均设3复孔。置于37℃、5%CO2培养箱中连续培养48 h，取出培养板，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续培养4 h，3000 r/min 离心 30 min，弃上清，每孔加入二甲亚砜(DMSO)200 μL，振荡10 min至形成的紫色结晶完全溶解，用酶标仪于570 nm波长处测定吸光度(A)值[7-8]。

2.2 PEAS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

参照文献[9]制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液，调整细胞浓度为1.4×106个/mL，将此细胞悬液按100 μL/孔接种于96孔细胞培养板，于37℃培养箱中培养2 h，弃上清。加入不同浓度的PEAS，每孔200 μL，同时设阴性对照组(培养基 200 μL)和阳性对照组(1 μg/mL LPS 200 μL)，每组均设 6 复孔。置于培养箱中孵育24 h后，弃上清，用D-Hanks液200 μL/孔洗 3遍，加入 0.075% 中性红溶液 200 μL/孔，于培养箱中孵育30 min后，弃上清，用 DHanks液 200 μL/孔洗 3遍，加入细胞裂解液(1 mol/L醋酸与等体积无水乙醇混合)200 μL/孔，微型振荡器上振荡3 min，37℃孵育1 h。测定其在570 nm波长处A值，吞噬中性红增加率(%)=(A给药－A对照)/A对照×100%。

2.3 PEAS对小鼠NK细胞活性的影响

效应细胞制备:常规制备小鼠脾淋巴细胞悬液，台盼蓝染色计数(活细胞数＞95%)，完全培养液调整细胞浓度至1×107/mL，按1 mL/孔接种于24孔细胞培养板，再加入高、中、低(500，100，20 μg/mL)浓度的PEAS溶液1 mL，并设置阴性对照(培养基1 mL)和阳性对照(Con A，终浓度为5 μg/mL)。于37℃，5%CO2培养箱中培养48 h，收集细胞，培养液洗3遍后调整细胞浓度至1×106/mL。

靶细胞的制备:取YAC-1细胞作为靶细胞，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，台盼蓝染色计数(活细胞数＞95%)。调整效靶比(E∶T)为50∶1，接种于 96 孔板，实验孔效、靶细胞各 100 μL，效应细胞对照孔加效应细胞、培养液各100 μL，靶细胞对照孔加靶细胞、培养液各100 μL，每组均设4个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，于各孔中加入5 mg/mL MTT溶液20 μL共同培养4 h。培养结束后，3000 r/min离心30 min，弃上清，每孔加入DMSO 200 μL，振荡10 min至形成的紫色结晶完全溶解，用酶标仪于570 nm波长处测定A值，结果以NK细胞活性表示。NK细胞活性(%)=[1 － (A实验孔(效+靶)－ A效应细胞对照孔)/A靶细胞对照孔]×100%[7，10]。

2.4 PEAS对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响

取小鼠脾淋巴细胞，调整细胞密度为5×107个/mL，加入24孔细胞培养板，每孔1 mL，每孔分别加入含不同浓度PEAS的RPMI 1640完全培养液1 mL，使 PEAS 终浓度分别为 20，100，500 μg/mL，并设阳性和阴性(终浓度5 μg/mL Con A和等体积细胞培养液)对照孔，每孔溶液终体积为2 mL，每组均设3复孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。1500 r/min离心15 min，弃去培养液，70%预冷乙醇重悬，混匀，置于4℃固定过夜。固定后的细胞1500 r/min离心10 min，弃去液体，各管加PI染液(PI 2.5 mg，RNase 5 mg，Triton X-10015 μL 溶于 PBS 50 mL中，过滤，4℃避光保存)200 μL，混匀后避光放置20 min，经300目尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞周期，计算脾淋巴细胞进入S期的细胞百分率[11]。

2.5 PEAS对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响

取小鼠脾淋巴细胞，调整细胞密度为5×107个/mL，加入24孔细胞培养板，每孔1 mL，每孔分别加入含不同浓度PEAS和含5 μg/mL Con A的混合液1 mL，PEAS 终浓度分别为 20，100，500 μg/mL，并设阴性对照孔(终浓度5 μg/mL Con A)，每孔溶液终体积为2 mL，每组均设3复孔。置37℃、5%CO2培养箱中分别培养24，48和72 h后，4℃，2000 r/min 离心10 min，收集上清，用于测定 IFN-γ、IL-4。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 PEAS对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用的影响

由图1可见，PEAS单药组在各个浓度作用下对小鼠脾淋巴细胞的增殖率均有显著增强作用(P＜0.01)，浓度在 125 μg/mL 以下具有量效关系，浓度大于125 μg/mL时，增殖率下降;PEAS协同LPS刺激B细胞，在浓度高于31.25 μg/mL时对B细胞的增殖具有显著促进作用(P＜0.01);PEAS协同Con A刺激T细胞，在浓度高于62.5 μg/mL时有显著增强作用(P＜0.05或0.01)，具有明显量效关系，且其对T淋巴细胞的增殖作用强于B淋巴细胞。

图1 PEAS对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响(，n=3)Fig.1 Effects of PEAS on the splenic lymphocytes proliferation in the mice(，n=3)

3.2 PEAS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

如表1所示，PEAS在浓度为 15.62 μg/mL时作用不显著(P ＞0.05)，在浓度为 31.25 μg/mL 及以上时，能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红(P＜0.01)，且呈量效关系。此结果表明，PEAS对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力有一定的促进作用。

表1 PEAS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红功能的影响(，n=6)Tab.1 Effect of PEAS on phagocytosis of mouse peritoneal macrophagocyte(，n=6)

表1 PEAS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红功能的影响(，n=6)Tab.1 Effect of PEAS on phagocytosis of mouse peritoneal macrophagocyte(，n=6)

与对照组比较:1P＜0.01 1P ＜0.01 vs control group

组 别 剂量/(μg/mL) A570 增加率/%对照组 －0.374 ±0.036 －PEAS 组 15.62 0.407 ±0.020 8.7131.25 0.473 ±0.0311 26.4662.50 0.474 ±0.0321 26.55125.00 0.548 ±0.0281 46.31250.00 0.543 ±0.0401 45.06500.00 0.564 ±0.0271 50.711000.00 0.576 ±0.0211 53.69 LPS 组 1.00 0.602 ±0.024160.71

3.3 PEAS对小鼠NK细胞杀伤活性的影响

从表2可见，PEAS在低浓度(20 μg/mL)对小鼠NK细胞活性有促进作用，但不显著(P＞0.05);在中、高浓度下对小鼠NK细胞活性有显著的促进作用(P＜0.05)，且在总体水平上随着PEAS浓度的升高而增强。

表2 PEAS对小鼠NK细胞杀伤活性的影响(，n=4)Tab.2 Effects of PEAS on NK cell cytoactive of mice in vitro(，n=4)

表2 PEAS对小鼠NK细胞杀伤活性的影响(，n=4)Tab.2 Effects of PEAS on NK cell cytoactive of mice in vitro(，n=4)

与对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01 1P ＜0.05，2P ＜0.01 vs control group

组 别 剂量/(μg/mL) A570 NK活性/%对照组0 0.246 ±0.039 16.75 PEAS 组 20 0.230 ±0.025 22.25100 0.215 ±0.0451 27.24500 0.186 ±0.0341 37.05 Con A 组 5 0.161 ±0.013245.60

3.4 PEAS对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响

与正常对照组相比，PEAS在高、中、低三个剂量(500，100，20 μg/mL)作用24 h 后，均能增加小鼠脾淋巴细胞进入S期细胞的百分率，且差异极显著(P ＜0.01)。PEAS 在高剂量(500 μg/mL)时效果最明显，其S期的比值增加了18.9%，见表3。

表3 PEAS对脾细胞周期分布的影响(，n=3)Tab.3 Effects of PEAS on the cell cycle of splenic lymphocytes of mice(，n=3)

表3 PEAS对脾细胞周期分布的影响(，n=3)Tab.3 Effects of PEAS on the cell cycle of splenic lymphocytes of mice(，n=3)

与对照组比较:1P＜0.01 1P ＜0.01 vs control group

剂量(G1/G0)S/% (G2/M)组 别 /(μg/mL)/% /%对照组0 76.7 ±0.82 20.7 ±0.32 1.8 ±0.12 PEAS 组 20 67.4 ±0.59 28.5 ±0.8311.8 ±0.32100 63.6 ±0.53 33.6 ±0.3312.0 ±0.41500 57.9 ±0.78 39.6 ±0.5811.9 ±0.37 Con A 组 5 49.7 ±0.61 46.7 ±0.7512.8 ±0.26

3.5 PEAS对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响

由表4可见，当PEAS协同Con A与细胞作用24 h后，TH1细胞因子IFN-γ的分泌量并没有显著的变化(P＞0.05)，在各浓度作用48或72 h后，IFN-γ的分泌量均增加(P ＜0.05或0.01)，并且在作用48 h后呈现出比较明显的量效关系;当PEAS协同ConA与细胞作用24，48或72 h后，在中、高浓度(100，500 μg/mL)作用下，TH2 细胞因子 IL-4 的分泌量显著减少(P＜0.05或0.01)。

表4 PEAS对脾细胞分泌细胞因子的影响(，n=3)Tab.4 PEAS regulated cell production of IFN-γ and IL-4(，n=3)

表4 PEAS对脾细胞分泌细胞因子的影响(，n=3)Tab.4 PEAS regulated cell production of IFN-γ and IL-4(，n=3)

与对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01 1P ＜0.05，2P ＜0.01 vs control group

剂量24 h48 h72 h组 别 /IFN-γIL-4IFN-γIL-4IFN-γIL-4(μg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)对照组 0 66.67 ±16.33 46.15 ±5.03 170.21 ±25.54 63.23±6.12 87.43 ±21.31 61.33 ±8.11 PEAS 组 20 53.33 ±7.33 55.49 ±8.22 233.33 ±33.351 58.35 ±4.45 153.36 ±21.561 46.39 ±5.14100 74.57 ±18.46 32.33 ±5.151 323.38 ±42.332 60.67 ±6.05 230.65 ±32.782 36.33 ±4.762 500 60.23 ±8.23 29.67 ±7.122 416.67 ±42.232 39.67 ±4.212146.82 ±24.671 41.32 ±5.341

4 讨论

淋巴细胞的增殖反应是机体细胞免疫反应的前提，淋巴细胞的增殖反映了机体非特异性细胞免疫的功能[9]。本实验选取了脾脏作为制取淋巴细胞的器官，通过淋巴细胞增殖实验表明PEAS可促进未活化的淋巴细胞增殖，也可促进经Con A或LPS活化的T或B淋巴细胞增殖(P＜0.05或0.01)。此结果提示PEAS可以增强T淋巴细胞及B淋巴细胞的增殖活性，且其本身具有有丝分裂原样作用。

巨噬细胞是体内的专职性抗原提呈细胞，是机体主要的免疫活性细胞之一。未活化的巨噬细胞的吞噬杀伤作用是有限的，巨噬细胞被激活后，其吞噬作用会增强。在本实验中，采用中性红吞噬法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，实验结果表明PEAS在浓度为31.25 μg/mL时，即可显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中功能(P＜0.01)，并且其吞噬功能在总体水平上随着PEAS浓度的升高而增强。此外，NK细胞为机体重要的免疫监视细胞，能非特异性的杀伤各种肿瘤细胞，本实验中利用对NK敏感的YAC-1细胞株作为靶细胞测定NK杀伤活性，结果表明PEAS能显著促进小鼠NK细胞活性(P＜0.05)。以上结果说明，PEAS能够活化腹腔巨噬细胞及NK细胞，提示其对机体的非特异性免疫功能具有一定的促进作用。

本文还采用PI染色法结合流式细胞术，观察了PEAS对脾淋巴细胞周期分布的影响。结果显示，PEAS能够显著促进脾淋巴细胞由G0/G1期向DNA合成期即S期转化(P＜0.01)，证明PEAS通过诱导淋巴细胞 DNA合成，而起到促淋巴细胞增殖的作用。

ELISA实验结果表明，PEAS能够显著增加Th1型细胞因子IFN-γ的分泌，并且降低Th2型细胞因子IL-4的分泌(P＜0.05或0.01)。说明PEAS有潜力应用于治疗由于Th2细胞因子分泌过多而导致的免疫疾病，促使Th细胞向Th2方向偏移的逆转，从而达到治疗免疫性疾病的目的。

本文的实验结果证明了PEAS对小鼠的免疫功能具有一定的正向调节作用，为其作用机制的阐明奠定了基础。

[1]蒋宏雷，施祥元，刘伟健.毛蚶(Scapharaca subcrenata Lischke)人工育苗技术的初步研究[J].现代渔业信息，2006，21(8):21-23.

[2]李 谦，李泰明，王香琴，等.毛蚶提取物生化性质初步分析[J].药物生物技术，1998，5(4):245-247.

[3]何赟绵，陈宇星，刘纯慧，等.毛蚶多糖的分离纯化和免疫活性测定[J].中国海洋药物2007，26(2):23-26.

[4]王 莉，何赟绵，姚全胜.毛蚶多糖免疫调节作用的实验研究[J].华西药学杂志，2009，24(4):340-342.

[5]Song L Y，Ren S F，Yu R M，et al.Purification，characterization and in vitro anti-tumor activity of proteins from Arca subcrenata Lischke[J].Mar Drugs，2008(6):418-430.

[6]任胜芳，宋丽艳，严春艳，等.毛蚶中抗癌活性肽高效液相指纹图谱分析研究[J].中药材，2008，31(8):1134-1138.

[7]李海瑞，吴希哲，徐韶瑜，等.海洋真菌多糖(YCP)对小鼠淋巴细胞免疫功能的影响[J].中国生化药物杂志，2007，28(2):91-93.

[8]金丽琴，薛胜霞，吕建新，等.牛膝多糖衍生物对小鼠脾淋巴细胞增殖及诱生IL-2和TNF-α的影响[J].中国生化药物杂志，2008，29(5):312-314.

[9]王翔岩.肉从蓉多糖的免疫调节活性及吸收特性研究[D].北京:北京协和医学院药用植物研究所，2009.

[10]王 剑，蒲 蔷，何开泽，等.川牛膝多糖的体外免疫活性研究[J].应用与环境生物学报，2008，14(4):481-483.

[11]季宇彬，高世勇，冯小燕，等.甜菜碱促进小鼠脾淋巴细胞增殖作用的钙通道机制研究[J].中国中药杂志，2009，34(15):1959-1963.