重楼总皂苷对胃癌细胞株MGC-803生长的抑制作用

2011-05-07 11:50吴庆琛

中国生化药物杂志 2011年4期

贾科，吴庆琛，张成

(1.重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016;2.川北医学院附属医院，四川南充 637000)

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居各类肿瘤的首位，胃癌的治疗除了手术、放疗和化疗外，中医药治疗也越来越受到人们的关注[1]。重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，主产于云南、四川及贵州等地[2]。现代药理研究显示重楼除了具有消炎、抑菌、镇静等作用外，还具有显著的抗肿瘤作用[3]。据报道，重楼的水提物、甲醇提取物和乙醇提取物对多种肿瘤细胞均有抑制作用，而皂苷是其主要药效成分[4]。本实验研究重楼总皂苷对胃癌细胞株MGC-803生长的抑制作用，并探讨其作用机制。

1 材料

重楼药材由重庆医科大学附属第一医院中药房提供，符合《中国药典》(2005版一部)的规定。

RPMI 1640培养基，美国Gibco公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)，美国 Sigma公司;survivin、Caspase-3兔抗人多克隆抗体和免疫组织化学二抗试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司;EphA2兔抗人多克隆抗体，Santa Cruz公司;流式细胞术二抗，Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司;胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)，北京华美公司。

人胃癌细胞株MGC-803，重庆市肿瘤研究所提供。

NAPCO series 5400 CO2培养箱，美国Nuair公司;Elx酶标仪，Bio-TEK-Instuments Inc;EPICS XL流式细胞仪，美国COULTER公司。

2 方法

2.1 重楼总皂苷的制备

重楼药材50 g，粉碎，加70%乙醇500 mL回流3 h，提取2次，合并滤液，减压浓缩除去乙醇。加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯除去亲脂性的成分，再用正丁醇萃取、浓缩得重楼总皂苷[5]。烘干称重，得0.4865 g，即每1 mg重楼总皂苷相当于重楼药材 0.103 g。

2.2 细胞培养

常规培养于含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，传代后取对数生长期细胞用于实验。

2.3 MTT法检测重楼总苷对细胞的生长抑制作用

将对数生长期胃癌细胞株MGC-803用0.25%胰蛋白酶消化后用RPMI 1640培养液制成2×104个/mL的细胞悬液，然后接种于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，吸出培养液，加入新鲜培养液180 μL及不同浓度重楼总皂苷溶液(重楼皂苷用DMSO溶解，DMSO终体积分数≤0.1%)20 μL，重楼总皂苷终浓度分别为10，20，40，80 和 160 μg/mL，每组设 6 个复孔，同时设空白对照和5-氟尿嘧啶(5-Fu)对照组。各组分别培养24，48，72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL ，继续培养4 h 后弃上清液，加DMSO 150 μL/孔，振荡溶解15 min，立即用酶标仪测定在570 nm波长处的吸光度(A)值。计算细胞生长抑制率[6]。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期的变化

根据MTT法检测结果，设置空白对照组、重楼总皂苷10，20，40 μg/mL组。将对数生长期胃癌细胞株MGC-803用0.25%胰蛋白酶消化后用RPMI 1640培养液制成2×104个/mL的细胞悬液，加入重楼总皂苷培养24或48 h后，用胰酶消化，收集细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，用70%乙醇悬浮细胞沉淀，于－20℃固定24 h以上。用PBS离心洗去乙醇加入碘化丙啶(PI)染液，避光染色30 min，过滤后用流式细胞仪于488 nm波长处检测DNA含量，分析细胞凋亡率和细胞周期[7]。

2.5 重楼总皂苷对EphA2、Survivin及Caspase-3表达的影响

应用流式细胞仪通过间接免疫荧光标记方法进行蛋白含量检测。以PBS为阴性对照，以二抗为阳性对照，用同型抗体替代抗体作为同型对照。以对数方式采集数据，以样品蛋白表达的平均荧光强度表示各组蛋白的含量。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 重楼总皂苷对MGC-803细胞生长的影响

结果见表1。重楼总皂苷浓度为10～160 μg/mL时均能显著抑制胃癌细胞株MGC-803细胞的生长，并且具有时间剂量依赖性和浓度依赖性。

表1 重楼总皂苷对MGC-803细胞生长的影响(，n=6)Tab.1 Effects of total saponins of paris polyphylla root on growth of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

与阴性对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with negative control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

组别浓度/(μg/mL)培养24 h A值抑制率/%培养48 h A值抑制率/%培养72 h A值抑制率/%阴性对照组－ 0.179 ±0.011 － 0.293 ±0.016 － 0.307 ±0.019 －5-Fu 对照组 10 0.142 ±0.0102 20.7 0.213 ±0.0112 27.3 0.162 ±0.0082 47.2重楼皂苷组 10 0.153 ±0.0121 14.5 0.243 ±0.0132 20.6 0.227 ±0.0152 26.120 0.112 ±0.0132 37.4 0.173 ±0.0152 41.0 0.166 ±0.0092 45.940 0.069 ±0.0092 61.5 0.111 ±0.0062 62.1 0.104 ±0.0122 66.180 0.065 ±0.0082 63.7 0.098 ±0.0082 66.6 0.098 ±0.0132 68.1160 0.059 ±0.0102 67.0 0.087 ±0.0072 70.3 0.081 ±0.007273.6

3.2 重楼总皂苷对MGC-803细胞周期及其凋亡率的影响

结果见表2。重楼总皂苷可使胃癌细胞株MGC-803的细胞周期发生明显改变，重楼总皂苷浓度为10～40 μg/mL时，随着浓度增加，G1/G0期DNA含量降低，S期DNA含量明显增加，G2/M期DNA含量变化不明显，因此重楼总皂苷可使胃癌细胞株MGC-803出现明显的S期阻滞。以二倍体峰(G0/G1)前出现亚G1峰表示凋亡细胞峰位，根据其分布组方图计算细胞凋亡率，随着重楼总皂苷浓度的增大，细胞凋亡率显著升高。

3.3 重楼总皂苷对 MGC-803细胞内 EphA2、survivin及Caspase-3蛋白表达的影响

结果见表3。重楼总皂苷可使胃癌细胞株MGC-803细胞内 EphA2、survivin及 Caspase-3蛋白表达发生明显变化。重楼总皂苷浓度为10～40 μg/mL时可显著下调EphA2和survivin蛋白的表达，而显著上调Caspase-3蛋白的表达。

表2 重楼总皂苷对胃癌MGC-803细胞周期及凋亡率的影响(，n=6)Tab.2 Effects of total saponins of paris polyphylla root on cell cycle and apoptosis rate of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

与阴性对照组比较:1P＜0.01Compared with negative control group:1P ＜0.01

组别浓度/(μg/mL)培养24 h G1/G0 S G2/M 凋亡率/%培养48 h G1/G0 S G2/M 凋亡率/%阴性对照组－ 63.3 ±1.8 35.3 ±1.5 1.4 ±0.1 1.18 ±0.24 73.5 ±1.5 24.8 ±1.2 1.7 ±0.2 1.57 ±0.35重楼皂苷组 10 59.3 ±1.4139.5 ±1.611.2 ±0.2 2.32 ±0.28167.3 ±1.8131.2 ±1.411.5 ±0.1 3.25 ±0.231 20 55.2 ±1.3143.7 ±1.411.1 ±0.1 5.34 ±0.56162.4 ±1.7136.0 ±1.511.6 ±0.2 8.76 ±0.621 40 50.3 ±1.6148.4 ±1.611.3 ±0.212.76 ±0.63158.3 ±1.6140.3 ±1.611.4 ±0.115.73 ±0.521

表3 重楼总皂苷对胃癌MGC-803细胞内EphA2、survivin及Caspase-3蛋白表达的影响(，n=6)Tab.3 Effects of total saponins of paris polyphylla root on protein expression of EphA2，survivin and Caspase-3 of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

与阴性对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with negative control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

组别浓度培养24 h培养48 h/(μg/mL)EphA2 Survivin Caspase-3EphA2 Survivin Caspase-3阴性对照组－ 12.0±1.2 11.6±1.3 12.4±1.8 18.2±1.4 17.6±1.3 15.5 ±1.6重楼皂苷组 10 10.2 ±1.51 9.8 ±1.61 15.4 ±2.11 9.6 ±1.02 9.2 ±1.3217.6 ±2.41 20 8.3 ±1.32 8.0 ±1.32 23.3 ±2.92 7.9 ±0.82 7.5 ±0.9228.6 ±2.22 40 6.5 ±1.12 6.7 ±1.42 36.5 ±2.42 6.1 ±0.92 6.2 ±1.3239.3 ±2.72

4 讨论

本研究采用MTT法观察重楼总皂苷胃癌细胞株MGC-803体外生长的抑制作用。重楼总皂苷浓度为10～160 μg/mL时均能显著抑制胃癌细胞株MGC-803细胞的生长，抑制作用随浓度的增加而增加，并且随着作用时间的延长而增加，表现出明显的浓度和时间依赖性。

有研究显示，重楼总皂苷可触发人低分化胃腺癌SGC-7901细胞、人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞以及人肺癌细胞 A549细胞的凋亡[6，8-9]。本研究中，胃癌细胞株MGC-803经10～40 μg/mL重楼总皂苷作用24和48 h后，采用流式细胞仪检测结果表明G1/G0期DNA含量降低，S期DNA含量明显增加，因此细胞被阻滞在S期，随着浓度的增加，细胞的凋亡率增加。因此，重楼总皂苷通过改变细胞周期来诱导凋亡。Survivin被认为是一种多肿瘤的通用抗原，几乎高表达于所有的恶性肿瘤，具有调节细胞增殖分裂和强大的抗凋亡功能[10]。Caspase-3是已知Caspase家族成员中执行凋亡的关键酶，是凋亡过程中最主要的终末剪切酶[7]。EphA2受体具有酪氨酸激酶活性，EphA2可高表达于多种恶性肿瘤组织，尤其高表达于高侵袭性的肿瘤细胞[11]。本研究结果显示，随着重楼总皂苷浓度增加，胃癌细胞株MGC-803凋亡率显著增加，并且伴随Survivin蛋白和EphA2蛋白表达减弱，而Caspase-3蛋白表达增强，因此可能为诱导胃癌细胞株MGC-803凋亡的机制之一。

因此，重楼总皂苷对胃癌细胞株MGC-803细胞体外生长具有一定的抑制作用，其作用机制可能通过抑制 Survivin和 EphA2蛋白的表达以及增强Caspase-3蛋白的表达来诱导肿瘤细胞的凋亡，其对胃癌的治疗作用还需在体内进行进一步研究。

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