血培养阳性标本直接细菌鉴定和药敏中应用分离胶试管的方法探讨

陈欢欢,文 怡,刘根焰,顾 兵,梅亚宁,陈友华

(南京医科大学第一附属医院医学检验科,江苏南京,210029)

临床上菌血症和败血症是严重危及患者生命的疾病,死亡率高达29%,因此快速诊断是控制感染、降低死亡率的关键。临床使用全自动血培养仪,提高了血培养的阳性率,也缩短了培养时间[1-2],但按常规法鉴定出细菌和药敏试验仍需要2～3 d。作者在对全自动血培养仪培养阳性的标本,直接吸取一定量血液,注入带分离胶试管中,离心后取上层液体直接用API鉴定试条鉴定细菌并进行药敏试验,同时与培养转种得到纯菌后常规方法鉴定和药敏试验结果比较,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年3月～2010年7月本院门诊及住院患者血培养阳性标本66例。

1.2 仪器与试剂

全自动血培养仪BACTEC 9120,美国O rganon2Tekn ika公司产品;API鉴定试条,法国BioM erieux公司产品;LD-2A离心机 北京医用离心机厂;哥伦比亚血琼脂基础、MH琼脂。药敏纸片:头孢唑啉、头孢噻肟、头孢吡肟、万古霉素、亚胺培南、头孢西丁、环丙沙星、丁胺卡那霉素、红霉素、克拉霉素、头孢他啶/克拉维酸、氨苄西林、复方新诺明均为英国Oxoid产品。质控菌株大肠埃希菌(ATCC 25922),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)。

1.3 方法

阳性标本离心集菌处理及快速检测:血培养仪培养阳性报警后,从阳性瓶中无菌抽取培养液约3 mL,注入带分离胶的试管中,置离心机2 000 rpm离心15 min后,吸取分离胶上层液,并轻轻混匀,直接涂片行革兰染色,根据染色结果,并通过触酶或氧化酶试验对细菌初步分群后,选择相应API鉴定试条进行细菌鉴定,再将离心上层液制备成0.5 M cFarLand菌悬液,直接用琼脂扩散法进行药物敏感试验,量取抑菌圈直径。

阳性标本的常规检测:血培养仪培养阳性报警后,从阳性瓶中无菌抽取培养液转种血平板、巧克力平板,经35℃培养18～24 h形成菌落后,取菌落涂片行革兰染色,根据染色结果,并通过触酶或氧化酶试验对细菌初步分群后,选择相API鉴定试条进行细菌鉴定,用K-B法进行药物敏感试验,量取抑菌圈直径,结果进行比较。

2 结 果

66例血培养阳性标本离心集菌处理后直接检测与转种获取菌落检测结果符合率:肠杆菌科22株,符合率100%;非发酵菌群10株,符合率85%;葡萄球菌属28株,符合率90%;肠球菌属6株,符合率92%。

血培养阳性标本离心集菌处理后与转种获取菌落药敏试验结果符合率见表1。

3 讨 论

如何对血培养阳性标本进行快速准确的菌种鉴定和药物敏感试验,始终困扰着临床微生物工作者。国内外临床微生物工作者,Ken、Marjan和T homas做了很多快速药敏的尝试,均也采用离心法对血培养阳性培养液进行处理后进行了直接上机MIC药敏[3-5],国内朱德全、文元和汪定成等报道类似的实验[6-7],曾有文献报道,直接用阳性标本作细菌鉴定和药物敏感试验,方便、快速。但由于血培养标本中血细胞等有型成分的存在,常影响直接取培养液涂片的革兰染色效果及判定。本研究采用含分离胶的试管处理阳性标本集菌后检测,经一定时间离心分层,可较为准确的得到无血细胞的菌悬液,以保证获得足够量的菌悬液。吸取菌悬液直接涂片后行革兰染色结果判定更直观,菌悬液亦可直接用于细菌鉴定和药物敏感试验,平均可提前一天报告阳性结果。

本研究的66株血培养阳性标本离心集菌处理及检测与常规检测结果表明:离心集菌处理后直接鉴定与常规检测两种方法对细菌菌种鉴定差异不大,符合率均大于85%。2种方法的药物敏感试验结果也相差不大,符合率均大于95.2%,结果比较满意,与国外Doren等报道96.8%相接近[8]。而葡萄球菌鉴定符合率高于国内一些报道[9]。

血清分离胶主要由硅胶,大分子碳氢化合物,疏水胶等组成。是具有触变性的粘性胶体,呈惰性,气密性好,比重 1.045～1.050,血球比重 1.060～1.080,血浆比重1.025～1.030。分离胶正好在血球与血浆之间。离心后,分离胶将两者分离开。血培养阳性标本在试管中经2 000 r/min,离心15 min,可以将其分成4层(从上至下):血浆层,细菌层,分离胶层,血球层。吸取分离胶层之上的细菌层,直接涂片染色,完全排除了血球对革兰染色结果判定的影响,涂片背景非常清晰,菌体易辨。血培养阳性标本溶液经离心后,细菌相对集中,制成一定菌量的悬液后可直接加到鉴定试条上。

本研究最大优点利用分离血培养阳性的培养液直接鉴定细菌,比常规方法转种平板后鉴定所需时间至少要缩短1～2 d。但仍有一些问题需要探讨,如本研究的菌种类别尚少,缺少真菌检出的报道;每次吸取阳性血培养瓶中的培养液中的菌量不同,对药敏试验结果是否影响;阳性瓶中如含有两种以上菌株,用离心集菌处理后直接鉴定就有一定困难。这都有待于今后进一步研究和探讨。

[1] 程彦国,张军民,赵莉莉,等.全自动培养仪的临床应用及评价[J].中华医学检验杂志,1999,22:74.

[2] 蒋燕群,卫 国,倪语星.应用全自动血培养仪提高血液、无菌体液培养的阳性率[J].中华医学检验杂志,1999,22:71.

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[9] 吴秋梅,叶晓卉,崔娴维,等.Bact/ALERT检测阳性的血培养标本直接用Vitek进行细菌鉴定的方法探讨[J].中华医院感染学杂志,2000,10(1):771.