黄鳝IRF-1和IRF-2保守序列的克隆与表达

顾琬雯，许巧情，宋 浪，李昊成，袁汉文 （长江大学动物科学学院，湖北荆州434025）

郝立平（湖北信息工程学校，湖北 荆门448124）

干扰素家族 （interferons，IFNs）是具有一系列多种功能的细胞因子，它们在抵抗病毒、调节细胞生长和调控免疫反应方面起着重要的作用。干扰素调节因子 （Interferon regulatory factors，IRFs）是在研究干扰素转录调控时发现的。迄今为止，在脊椎动物中共发现10种干扰素调节因子，即IRF-1～IRF-10。它们的主要作用是调节干扰素和干扰素诱导基因的表达[1]。此外，IRFs在造血细胞分化、免疫基因的调节中也发挥重要的作用[2]，同时IRFs还参与Toll-like信号通路和其他的模式识别受体的免疫反应[3]。

鱼类作为一类非常重要的脊椎动物，对其免疫基因的研究有助于阐明其免疫机理和功能。目前，在鱼类中已经报道了几种IRFs的基因组结构和表达。例如IRF-1在虹鳟 （Oncorhynchusmykiss）[4]、大菱鲆 （Scophthalmusmaximus）[5]、鳜 （Sinipercachuatsi）[6]，IRF-2 在虹鳟[4]和 鳜[7]，IRF-3 在虹鳟[8]，IRF-6在斑马鱼 （Daniorerio）[9]，IRF-7在鳜[6]、虹鳟[8]和大西洋鲑 （Salmosalar）[10]中均有报道。而IRF-1和IRF-2在黄鳝 （Monopterusalbus）中尚未见任何报道。黄鳝集约化养殖程度大、种质资源退化、养殖水环境恶化，其病害的发生率愈来愈高，严重制约着黄鳝养殖业的发展，而加强对黄鳝免疫因子的研究可为黄鳝的疾病防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

受试黄鳝来自长江大学黄鳝养殖基地，体重约100g，在实验室暂养2～3d后用于试验。

1.2 黄鳝RNA的提取及反转录

取新鲜的脾脏、中肾、肠等混合组织共100mg，迅速加入Trizol，冰上放置或冷冻于-80℃中。使用Trizol®Reagents提取黄鳝组织总RNA。然后参照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit的方法合成cDNA，分装保存于-20℃中。

1.3 黄鳝IRF-1和IRF-2cDNA中间序列的扩增

根据 NCBI上的鳜 （登录号为 AY647431.1）、大黄鱼 （Larimichthyscrocea，登录号为GU175707.2）、斜带石斑鱼 （Epinepheluscoioides，登录号为 GU988700.1）和大西洋鲑 （Salmosalar，登录号为CBL58209.1）IRF-1cDNA序列的保守部分设计简并引物IRF-1-F1和IRF-1-R1，扩增黄鳝IRF-1cDNA的中间序列 （登录号为JN695589）（表1）；根据NCBI上的牙鲆 （Paralichthysolivaceus，登录号为JF312911.1）、虹鳟 （登录号为 NM ＿001124438.1）和斜带石斑鱼 （登录号为FJ828965.1）IRF-2cDNA序列的保守部分设计简并引物IRF-2-F1和IRF-2-R1，扩增黄鳝IRF-2cDNA的中间序列 （登录号为JN695590）（表1）。

表1 扩增IRF-1／IRF-2cDNA序列以及表达所用的引物

1.4 系统进化树的构建

利用NCBI上已有的蛋白序列和黄鳝4种IRFs蛋白序列构建系统进化树，各个物种蛋白序列的登录号见表2。进化树采用MEGA 4.0构建。

1.5 黄鳝不同组织和不同发育阶段IRF-1和IRF-2的表达

1.5.1 RNA的提取

在长江大学黄鳝养殖基地选取3个发育阶段 （雌性、间性和雄性）的黄鳝各3尾，在实验室暂养1周后分别取雌鳝、间性黄鳝、雄鳝的中肾和脾脏组织，迅速加入Trizol，冰上放置，使用Trizol®Reagents提取黄鳝组织总RNA，方法同1.2所述，所得样本作为研究不同发育阶段表达之用。取3尾暂养1周后的雄鳝，分别取其新鲜的性腺、肌肉、血液、皮肤、肠、中肾、脾脏、肝脏 脑各100mg，迅速加入Trizol，冰上放置，使用Trizol®Reagents提取黄鳝组织总RNA，方法也同1.2所述，所得样本作为研究不同组织表达之用。

1.5.2 RNA样品中DNA的处理

取2μl溶于DEPC水的RNA，1μl在紫外分光光度计上测出RNA样品的浓度，1μl进行电泳，根据所测RNA的浓度和电泳结果，取2μl总RNA用进行DNase I处理。反应体系为：RNA 2μg，10×DNase I Buffer 2μl，DNase I（RNase-free，1U／μl，Fermentas）2μl，RNase Inhibitor（40U／μl，Fermentas）1μl，DEPC-treated H2O直至20μl。将反应液短暂离心以混匀，PCR仪上37℃运行30min。然后向离心管加入1μl 25mmol／L EDTA处理65℃，然后立即置于冰上或者-80℃冻存。

1.5.3 cDNA模板的准备

参照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit的方法合成cDNA，分装保存于-20℃中。

1.5.4 β-actin、IRF-1和IRF-2基因的扩增

利用已测序验证的IRF-1、IRF-2中间序列设计特异引物IRF-1-RT-F2、IRF-1-RT-R2和IRF-2-RT-F2、IRF-2-RT-R2，利用黄鳝β-actin基因 （登录号为AY345056.1）设计引物β-actin F和β-actin R。

分别采用β-actin F／β-actin R、IRF-1-RT-F2／IRF-1-RT-R2和IRF-2-RT-F2／IRF-2-RT-R2引物对上述9个组织或3个不同发育阶段的中肾和脾脏cDNA模板进行扩增。取β-actin PCR产物电泳，根据9个组织或不同发育阶段的中肾和脾脏电泳条带强弱调节PCR扩增后的模板加入体积，直至9个组织或不同发育阶段的中肾和脾脏6个样本的β-actin基因扩增条带亮度基本一致。按照同样体积的模板量进行IRF-1和IRF-2的电泳，揭示黄鳝不同发育阶段或不同组织IRF-1和IRF-2基因的表达情况。β-actin扩增程序为：95℃变性5min；94℃30s，56℃20s，72℃20s，运行25个循环；72℃延伸10min；IRF-1和IRF-2扩增程序均为：94℃ 变性5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，运行35个循环。

2 结果与分析

2.1 黄鳝IRF-1和IRF-2保守序列及分析

已扩增到的IRF-1cDNA长507bp（GenBank登录号：JN695589），编码168aa（图1）。IRF-2cDNA长794bp（GenBank登录号：JN695590），编码264aa（图2）。

图1 黄鳝IRF-1的核酸序列和推断的氨基酸序列 （登录号为JN695589）

图2 黄鳝IRF-2的核酸序列和推断的氨基酸序列 （登录号为JN695590）

利用NCBI上已有的蛋白序列和黄鳝4种IRFs蛋白序列，采用MEGA 4.0构建系统进化树，结果如图3。从图3可以看出，各种脊椎动物的IRF-2聚集在一起，成为一束，黄鳝IRF-2（MaIRF2）与斜带石斑鱼IRF-2（EcIRF2）最为接近；黄鳝IRF-1（MaIRF1）与鳜 （ScIRF1）和大黄鱼 （LcIRF1）最为接近，它们与大西洋鲑 （SsIRF1）和草鱼 （CiIRF1）聚集在一起，形成一大束，但斑马鱼IRF-1（DrIRF1）却与其他鱼类的IRF-1相距较远，而与所有生物的IRF-1和IRF-2聚合在一起，这说明从进化上讲IRF-1和IRF-2亲缘关系较近。

2.2 黄鳝不同发育阶段IRF-1和IRF-2的表达

IRF-1-RT-F2／IRF-1-RT-R2在黄鳝cDNA上扩增的片段大小为507bp，β-actin F／β-actin R扩增的片段长度为397bp（图4A）。从图4A可以看出，黄鳝3个不同的发育阶段即雌性、间性和雄性的中肾和脾脏组织IRF-1的表达量基本一致，无明显的差别。

IRF-2-RT-F2／IRF-2-RT-R2在黄鳝cDNA上扩增的片段大小为577bp，F／β-actin R扩增的片段长度为398bp（图4B）。图4B显示，黄鳝3个不同的发育阶段即雌性、间性和雄性的中肾和脾脏组织IRF-2的表达量基本一致，无明显的差别。

2.3 黄鳝不同组织IRF-1和IRF-2的表达

黄鳝性腺、肌肉、血液、皮肤、肠、中肾、脾脏、肝脏和脑等组织IRF-1和IRF-2的表达情况见图5，其中IRF-1血液、皮肤、肠、中肾和肝脏有明显清晰的条带，说明在这5种组织中表达量较高，其次为性腺、脾脏和脑，而肌肉中表达量很弱，基本看不到条带 （图5A）。中肾的IRF-2条带最清晰，说明IRF-2的表达量最高，其次为肠和脾脏，肝脏、脑、血液、皮肤和性腺IRF-2表达很弱，肌肉中基本看不到明显的扩增条带，说明IRF-2在肌肉中表达量很低 （图5B）。

3 讨论

图3 黄鳝IRF-1和IRF-2与其他脊椎动物IRF-1和IRF-2的进化关系

图4 黄鳝不同发育阶段IRF-1（A）和IRF-2（B）的表达

干扰素调节因子是调节干扰素以及干扰素相关基因的转录因子[11]。它们在结构特征上具有保守的序列特征，所有成员前115个氨基酸同源性较高，具有4～6个保守间隔排列的色氨酸，具有螺旋-转角-螺旋的DNA结合结构域 （DNA binding domain，DBD）[3]。IRF-1是发现的第一个能在体外激活I型干扰素的干扰素调节因子，最初研究表明：IRF-1能够结合到IFN-β启动子区域的正向调节区I，对IFN-β的转录起促进作用[12]。但进一步研究表明，在病毒激活的细胞质I型干扰素产生的通路中并不一定要IRF-1的介导[13]。IRF-2通常被认为是一个转录抑制因子，对IRF-1起着拮抗的作用。IRF-2结合干扰素或干扰素诱导基因的ISRE序列的能力是IRF-1的数十倍，从而一直这些基因的表达[14]。

图5 黄鳝不同组织IRF-1（A）和IRF-2（B）的表达

鱼类IRF-1最早是在牙鲆 （Paralichthysolivaceus）发现的[15]。从牙鲆cDNA文库中筛选出一个长1746bp的序列，当时命名为fIRF，fIRF与已报道的鸟和哺乳动物的IRF-1和IRF-2相似性达40%。而且，fIRF的DNA结合域具有IRF家族最典型的5个色氨酸残基。随后，在其他鱼类中开展了大量的研究。利用细胞巨化病毒介导的增强子构建的牙鲆IRF-1重组质粒，在同源细胞系中用转染试验研究牙鲆抗病毒机制，结果表明牙鲆IRF-1通过产生类似于细胞因子的产物来诱导细胞发挥抗病毒作用[16-17]。同时，过量表达的IRF-1能调控IFN以及ISG基因的表达[18]。为了研究IRF-1的抗病毒机理，亚细胞定位揭示鲫IRF-1有2个核定位信号，它们均能促使IRF-1从细胞质转移至细胞核中，这就充分地阐明了鱼类IRF-1在病毒感染前后的迁移规律。此外，还有学者对鱼类IRF-1和IRF-2基因的启动子活性进行了研究。以虹鳟IRF-1A启动子构建的鱼类特异性表达载体pIRF-1A-G，作为DNA疫苗免疫虹鳟后，能在体内成功表达IHNV的G蛋白，使鱼体获得免疫保护反应[19]；Collet等[20]将虹鳟IRF-2基因上游启动子克隆到报道基因载体pGL3-basic中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定试验证明IRF-2基因上游启动子具有较强的启动子活性，这些都将有助于进一步阐明IRF-1和IRF-2的功能。

IRF-1和IRF-2的表达规律已有许多相关报道。在其他鱼类中，IRF-1和IRF-2广泛地表达于各种组织或器官[5，6，21，22]，呈现组成型表达。本研究表明IRF-1和IRF-2在黄鳝3个不同发育阶段表达规律基本一致，而在检测的9种组织中IRF-1血液、皮肤、肠、中肾和肝脏表达量较高，而IRF-2在中肾、肠和脾脏中表达量较高，这与大黄鱼[23]、斜带石斑鱼[21]、鳜[6]的表达规律基本一致，但与牙鲆[15]、虹鳟[4]和红鳍东方鲀 （Fugurubripes）[24]存在一定差异，这可能是不同的鱼类生长的环境不同造成的。此外，IRF-1和IRF-2在诱导后表达量会显著上升。牙鲆在轮状病毒（rotavirus）和迟钝爱得华氏菌 （Edwardsiellatarda）免疫后，IRF-1mRNA表达量均得到上调[15]；虹鳟IRF-1用Poly I：C腹腔注射虹鳟后，鳃、头肾、肝脏和脾脏中IRF-1表达量均明显上升[4]；Poly I：C能鳜鱼诱导IRF-2的表达[7]。这些说明IRF-1和IRF-2在鱼类抵抗病原菌的防御中起着十分重要的作用。

[1]Mamane Y，Heylbroeck C，Genin P，et al.Interferon regulatory factors：the next generation [J].Gene，1999，237：1-14.

[2]Colonna M.TLR pathways and IFN-regulatory factors：to each its own [J].Eur J Immunol，2007，37：306-309.

[3]Tamura T，Yanai H，Savitsky D，et al.The IRF family transcription factors in immunity and oncogenesis [J].Annu Rev Immunol，2008，26：535-584.

[4]Collet B，Hovens G C，Mazzoni D，et al.Cloning and expression analysis of rainbow troutOncorhynchusmykissinterferon regulatory factor 1and 2（IRF-1and IRF-2）[J].Dev Comp Immunol，2003，27：111-126.

[5]Ordas M C，Abollo E，Costa M M，et al.Molecular cloning and expression analysis of interferon regulatory factor-1（IRF-1）of turbot and sea bream [J].Mol Immunol，2006，43：882-890.

[6]Sun B J，Chang M X，Song Y，et al.Gene structure and transcription of IRF-1and IRF-7in the mandarin fishSinipercachuatsi[J].Vet Immunol Immunopathol，2007，116：26-36.

[7]Sun B，Chang M，Chen D，et al.Gene structure and transcription of IRF-2in the mandarin fishSinipercachuatsiwith the finding of alternative transcripts and microsatellite in the coding region [J].Immunogenetics，2006，58：774-784.

[8]Holland J W，Bird S，Williamson B，et al.Molecular characterization of IRF-3and IRF-7in rainbow trout，Oncorhynchusmykiss：functional analysis and transcriptional modulation [J].Mol Immunol，2008，46：269-285.

[9]Ben J，Jabs E W，Chong S S.Genomic，cDNA and embryonic expression analysis of zebrafish IRF-6，the gene mutated in the human oral clefting disorders Van der Woude and popliteal pterygium syndromes [J].Gene Expr Patterns，2005，5：629-638.

[10]Kileng O，Bergan V，Workenhe S T，et al.Structural and functional studies of an IRF-7-like gene fromAtlanticsalmon[J].Dev Comp Immunol，2009，33：18-27.

[11]Huang B，Qi Z T，Xu Z，et al.Global characterization of interferon regulatory factor（IRF）genes in vertebrates：Glimpse of the diversification in evolution [J].BMC Immunol，2010，11：22.

[12]Escalante C R，Yie J，Thanos D，et al.Structure of IRF-1with bound DNA reveals determinants of interferon regulation [J].Nature，1998，391：103-106.

[13]Matsuyama T，Kimura T，Kitagawa M，et al.Targeted disruption of IRF-1or IRF-2results in abnormal type I IFN gene induction and aberrant lymphocyte development [J].Cell，1993，75：83-97.

[14]Sato M，Taniguchi T，Tanaka N.The interferon system and interferon regulatory factor transcription factors-studies from gene knockout mice [J].Cytokine Growth Factor Rev，2001，12：133-142.

[15]Yabu T，Hirose H，Hirono I，et al.Molecular cloning of a novel interferon regulatory factor in Japanese flounder，Paralichthys olivaceus[J].Mol Mar Biol Biotechnol，1998，7：138-144.

[16]Caipang C M，Hirono I，Aoki T.Induction of antiviral state in fish cells by Japanese flounder，Paralichthysolivaceus，interferon regulatory factor-1 [J].Fish Shellfish Immunol，2005，19：79-91.

[17]Caipang C M，Hirono I，Aoki T.Modulation of the early immune response against viruses by a teleostean interferon regulatory factor-1（IRF-1）[J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2009，152：440-446.

[18]史 燕，赵 哲，张义兵，等.鲫鱼干扰素调节因子1功能初步研究 [J].水生生物学报，2008，32（4）：509-514.

[19]Alonso M，Johnson M，Simon B，et al.A fish specific expression vector containing the interferon regulatory factor 1A （IRF1A）promoter for genetic immunization of fish [J].Vaccine，2003，21 （15）：103-109.

[20]Collet B，McDonald C，Sombes C J.The promoter for the Interferon Regulatory Factor（IRF）-2in the rainbow troutOncorhynchus mykiss：cloning and reporter gene activity [J].Fish Shellfish Immunol，2003b，15：473-477.

[21]Shi Y，Zhu X P，Yin J K，Zhang Q Y，Gui J F.Identification and characterization of interferon regulatory factor-1from orangespotted grouper（Epinepheluscoioides）[J].Molecular Biology Reports，2010，37：1483-1493.

[22]张 跃，白俊杰，李英华，等.牙鲆干扰素调节因子核心区序列的克隆及初步表达 [J].中国水产科学，2001，8（2）：10-13.

[23]Yao CL，Kong P，Huang X N，et al.Molecular cloning and expression of IRF1in large yellow croaker，Pseudosciaenacrocea[J].Fish Shellfish Immunol.2010，28 （4）：654-660.

[24]Richardson M P，Tay B H，Goh B Y，et al.Molecular cloning and genomic structure of a gene encoding interferon regulatory factor in the pufferfish（Fugurubripes）[J].Mar Biotechnol（NY），2001，3：145-151.