基于DNA条形码进行金花茶组种间鉴别

陈 莹， 郭蓓琳， 姚丽敏， 潘王韵， 曾菁菁， 吕祉龙， 杜彦蓉， 闫淑君

(福建农林大学园林学院， 福州 350002)

DNA条形码(DNA barcoding)是根据对一段标准的DNA序列的分析来鉴定物种，已成为生物物种鉴定的新方向，受到世界40多个国家130多个组织中传统生物分类学家、分子生物学家和生物信息学家等多学科专家的关注[1]。金花茶属于山茶科、山茶属，是山茶属中罕有的花色金黄的品种[2-3]，被誉为“茶族皇后”及植物界的“大熊猫”。金花茶富含多种对人体健康有益的微量元素, 在医疗方面具有良好的功效，如利尿利湿, 清热解毒等。常用于治疗咽喉发炎、尿路感染、水肿、痢疾、高血压、预防肿瘤等疾病[4-5]。近年来许多动物学实验研究表明, 金花茶具有提高机体免疫、抑制肿瘤增生、降血脂、降血糖等多种生理功能, 是优良的功能性食品原料。植物类黄酮普遍存在于很多植物体内。随着研究的不断深入, 葛根黄酮、银杏黄酮等黄酮类成分在医药领域获得了广泛应用，并且取得了长足的发展。但不同金花茶黄酮含量不同[5]，其中柠檬金花茶黄酮含量最高。金花茶通过外观很难辨别[4-7]。本研究应用ITS、psbA-tmH、rpl 16、rpl 32、trnl-trnF序列对薄叶金花茶(Camelliachrysanthoides)、金花茶(Camellianitidissima)、显脉金花茶(Camellieuphlebia)、柠檬金花茶(Camellialimonia)、小花金花茶(Camelliamicrantha)、凹脉金花茶(Camelliaimpressinervis)、小瓣金花茶(Camelliaparvipetala)、东兴金花茶(Camelliatunghinensis)、毛瓣金花茶(Camelliapubipetala)进行鉴定，为金花茶的准确鉴定提供科学依据[10]。

1 材料与方法

1.1 样 本

从GenBank下载不同来源的金花茶序列。

薄叶金花茶：1个psbA-tmH序列(登录号：GQ 487336.1)、1个rpl 16序列(登录号：GQ 487366.1)及2个trnl-trnF序列(登录号：HQ 158589.1，GQ 487426.1)；

金花茶： 1个psbA-tmH序列(登录号：GQ 487354.1)、1个rpl 16序列(登录号：GQ 487384.1)及1个trnl-trnF序列(登录号：GQ 487444.1)；

显脉金花茶：1个psbA-tmH序列(登录号：GQ 487339.1)、1个rpl 16序列(登录号：GQ 487369.1)及1个trnl-trnF序列(登录号：GQ 487429.1)；

凹脉金花茶：1个rpl 16序列(登录号：GQ 487376.1)及2个trnl-trnF序列(登录号：HQ 158590.1，GQ487436.1)；

柠檬金花茶：1个rpl 16序列(登录号：GQ 487379.1)及1个trnl-trnF序列(登录号：GQ 487439.1)；

小花金花茶：1个psbA-tmH序列(登录号：GQ 487352.1)、1个rpl 16序列(登录号：GQ 487382.1)及2个trnl-trnF序列(登录号：HQ 158565.1，GQ 487442.1)；

小瓣金花茶：1个psbA-tmH序列(登录号：GQ 487356.1)、1个rpl 16序列(登录号：GQ 487386.1)及1个trnl-trnF序列(登录号：GQ 487446.1)；

东兴金花茶：1个rpl 16序列(登录号：GQ 487371.1)及1个trnl-trnF序列(登录号：GQ 487431.1)；

毛瓣金花茶：1个rpl 16序列(登录号：GQ 487387.1)及1个trnl-trnF序列(登录号：GQ 487447.1)。

1.2 序列处理

利用NCBI虚拟PCR的方法来获取薄叶金花茶、金花茶、显脉金花茶、簇蕊金花茶、弄岗金花茶、凹脉金花茶、柠檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、东兴金花茶、淡黄金花茶、毛瓣金花茶ITS、psbA-tmH、rpl 16、rpl 32、trnl-trnF序列等共有的对应区段，以备后续研究。

1.3 数据分析

利用MEGA 5.0软件进行种内种间Kimura 2-parameter(K 2 P)遗传距离分析，构建邻接(NJ)系统聚类树及最近距离法(Nearsest distance)对薄叶金花茶、金花茶、显脉金花茶、簇蕊金花茶、弄岗金花茶、凹脉金花茶、柠檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、东兴金花茶、淡黄金花茶、毛瓣金花茶进行鉴定分析。

2 结 果

2.1 trnl-trnF序列

2.1.1序列分析

利用NCBI虚拟PCR的技术方法来获取所下载长短不同的薄叶金花茶、金花茶、凹脉金花茶、柠檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、东兴金花茶、显脉金花茶、毛瓣金花茶trnl-trnF序列中共有的对应片段，在系列1～822 bp之间获得共有对应系列，在345～349 bp间存在SNP位点。

2.1.2系统聚类树鉴定结果

利用Meg 5.0软件对所获得样本的trnl-trnF序列进行构建NJ系统聚类树，详见图2。

由图2可知：trnl-trnF序列条形码可将显脉金花茶系列单独聚为一类，结果表明，trnl-trnF序列可应用于显脉金花茶与薄叶金花茶、金花茶、柠檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、凹脉金花茶、东兴金花茶、毛瓣金花茶等8种金花茶之间的鉴别。

2.2 psbA-tmH序列

2.2.1序列分析

利用NCBI的技术方法来获取所下载长短一致的薄叶金花茶、金花茶、毛瓣金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、凹脉金花茶、显脉金花茶、东兴金花茶psbA-tmH序列中共有的对应片段。在161～452 bp系列之间获得共有对应系列，在该片段中，仅有7个SNP位点，位点突变率仅达2.397%，可见在该系列中样品进化上的变异极小。并且在342 bp上毛瓣金花茶样本存在与其他样本特异性差别。

2.2.2系统聚类树鉴定结果

应用Meg 5.0软件对所获得样本的psbA-tmH序列进行构建NJ系统聚类树，详见图4。

由图4可知，psbA-tmH序列条形码可将毛瓣金花茶系列单独聚为一类，结果表明，psbA-tmH序列可应用于毛瓣金花茶与薄叶金花茶、金花茶、凹脉金花茶、小花金花茶、显脉金花茶、小瓣金花茶、东兴金花茶等7中金花茶之间的鉴别。

2.3 rpl 16序列

2.3.1系列分析

利用NVBI虚拟PCR方法获取长短不一致的薄叶金花茶、金花茶、显脉金花茶、凹脉金花茶、柠檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、东兴金花茶、毛瓣金花茶的rpl 16序列系列中共有的对应片段，在105～786 bp系列之间获得共有对应系列，在该片段内，位点突变率仅达1.320%，仅有9个SNP位点，可见在该系列中各样本进化上的变异极小。在102、104 bp上，薄叶金花茶样本与其他样本存在特异性差别。

2.3.2系统聚类树鉴定结

应用Meg 5.0软件对所获得样本的rpl 16序列进行构建NJ系统聚类树，详见图6。

由图6可知：rpl 16序列条形码可将毛瓣金花茶单独聚类为一类，结果表明，rpl 16系列可应用于毛瓣金花茶与薄叶金花茶、金花茶、显脉金花茶、凹脉金花茶、柠檬金花茶、小花金花茶、小瓣金花茶、东兴金花茶等8种金花茶的鉴别。

3 结果与讨论

金花茶组植物(CamelliaSect.ChrysanthaChang)是一组唯一以黄色花朵著称的山茶科山茶属植物。金花茶组在园林与医药中均有较广泛的应用，自1979年建立金花茶组植物以来，新种和新变种以及变型的不断公布，但由于形态极其相似，其品种之间的鉴别困难，金花茶组植物之间的关系难以通过经典分类学进行区分[2-3,7]。急需准确快速的鉴定方法。近几年来，DNA条形码技术以其统一的操作标准和高稳定性与可靠性的鉴定结果，在中药基源的鉴定方面已经被广泛应用[8-9]。本研究以trnl-trnF、rpl 16、psbA-tmH基因序列作为对金花茶组的DNA条形码进行了分析。本研究运用生物信息学的手段对不同金花茶的psbA-tmH、rpl 16、与trnl-trnF序列条形码进行遗传距离与聚类分析，结果表明trnl-trnF序列最多只能在这些金花茶样本中区分出显脉金花茶。rpl 16系列可准确地鉴别出毛瓣金花茶。psbA-tmH序列能准确鉴别毛瓣金花茶。本研究所确定适用于对不同金花茶品种的条形码序列，为进一步利用不同条形码进行分子生物学鉴定提供依据。