藜麦种质资源的遗传多样性分析

吴文强， 杨 箐， 陈天青， 王 伟， 隋建枢， 罗永露， 何庆才

(1.贵州省旱粮研究所， 贵阳 550006； 2.贵州医科大学， 贵阳 550025；3.贵州省农业科学院， 贵阳 550006)

藜麦属于苋科，藜属，是一年生常异花授粉的异源四倍体植物(2 n=4 x=36)[1-2]，单倍染色体数目为9[2]，原产于南美洲安第斯山脉地区，在当地已有约7 000年的种植历史，属于当地最重要的粮食作物之一，被当地印加人称为“粮食之母”。藜麦具有耐旱、耐寒、耐盐碱、耐瘠薄等特性，是喜高海拔和冷凉的作物，从海拔0～4 000 m都有分布，食用的品种主要种植在安第斯山海拔3 000 m以上、降雨量300 mm以上的山区[3]。研究发现，藜麦的矿物质、蛋白质、纤维素、氨基酸、微量元素含量高，特别是蛋白质含量最高(达22.1%)，远高于其他谷物[1]，并富含一般谷物缺少的赖氨酸[5]。藜麦由于自身的营养价值及其所含的特殊化学成分——皂苷(一类具有抗炎症、抗真菌和增强免疫等多种生理活性的化学成分[6-7])、类黄酮(一类具有抗氧化性和抗炎症特性的化学成分[8])，并且，因其低糖、低热量，对于肥胖人群、“三高”人群以及糖尿病患者来说，是一种首选食物。因此，藜麦被FAO正式推荐为最适宜人类的完美“全营养食品”，并列为全球十大健康营养食品之一[3-4]。

近年来，藜麦的需求量大幅度上升，我国开展了藜麦的引种和试种[9-10]。但如何利用现有的种质资源，提高藜麦的产量和农艺性状改良方面存在制约瓶颈。而藜麦种质资源的遗传多样性分析是解决问题的关键因素之一，目前关于此方面的研究鲜见报道。

SSR技术被认为是研究群体遗传变异的最好标记，在遗传多样性分析研究中已广泛应用[11-14]。

本研究以从国内外引进的96份藜麦种质资源为研究对象，在贵州进行种植，并基于SSR标记的遗传多样性分析，确定藜麦种质间的亲缘关系、评定其遗传多样性水平，为今后藜麦育种中的杂交组配提供理论依据，从而筛选适宜贵州种植的藜麦品种。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1供试藜麦种质材料

本研究采用的96份藜麦种质材料主要引自甘肃农业科学院畜草与绿色农业研究所和中国农业科学院品种资源研究所等。

在2018年6—10月，于贵州省农业科学院旱粮研究所(贵阳)试验基地选择水肥条件一致，肥力均匀的地块作为实验用地，用于种植，该地海拔为1 100 m；6月2日在大棚用育苗钵育苗，6月7日出苗，7叶时移栽于大田，每份种质种植1个小区，小区面积15 m2，小区长5 m、宽3 m，行距1 m，株距50 cm，每小区27株，密度为18 000株·hm-2。9月上旬至10月上旬不同种质成熟时进行收获。

1.1.2SSR引物信息

根据前人的相关研究合成了26对引物，并在不同藜麦材料中进行扩增，选出其中扩增较好、多样性较高、条带清晰的18对引物进行遗传结构和多样性分析。其中，所有引物是根据Jarvis[17]等获得的多态性SSR标记中筛选。

1.2 实验方法

1.2.1藜麦基因组DNA提取

苗期于田间采集96份幼嫩藜麦叶片，用液氮研磨后，采用CTAB法提取DNA。

1.2.2PCR扩增

采用扩增较好、多样性较高、条带清晰的18对引物和PCR扩增程序对供试的96份材料进行基因型鉴定。

1.2.3数据统计及处理

根据SSR标记显示的带型，记录易于辨认的多态性位点，有带记为1，无带记为0，建立1，0型二元矩阵。将0，1矩阵在NTSYSpc(2.10版)软件中进行处理，根据相似系数(Similarity coefficient)构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测部分引物电泳图(120 V、5 h)

利用筛选的18对SSR引物对96份藜麦资源进行PCR扩增，电泳结果显示条带清晰、多态性好、扩增较好。部分引物电泳图见图1、图2。

2.2 PCR反应结果分析

本研究中，用26对SSR引物对96个供试藜麦种质材料(系)进行多态性分析。结果表明，用26对SSR引物对96个供试藜麦种质材料(系)基因组DNA进行PCR扩增反应，筛选出18对引物具有多态性，多态位点百分率(P)为69.3%。18对多态性引物共检测出192个等位位点，引物等位点数在3～21个之间(表1)，平均每个引物等位位点数为10.7个，由于等位位点数与遗传多样性呈正相关，等位位点数越多，遗传多样性越丰富，故该96个供试藜麦种质材料的遗传多样性相对丰富。从图3得到，引物KAAT 019的等位位点数最多，为21个，其次KAAT 021和KAAT 027，均为16个，KCAA 033和KGA 038的等位位点数最少，均为3个。引物KAAT 019对91个藜麦种质资源(系)扩增结果见图4，其片段大小为140～250 bp，共21种等位位点。

2.3 藜麦种质资源的遗传相似系数分析比较

将记录条带的0，1矩阵在NTSYSpc(2.10版)软件中进行处理，根据SSR标记计算藜麦种质资源间遗传相似系数，得到96份藜麦材料遗传相似系数范围为0.559～0.980，平均值为0.789 5。其中，LM 13-2与LM 14-3遗传相似系数最高，为0.980，表明两者亲缘关系最近。而LM 03-3-2与LM 12 a间的遗传相似系数最低，为0.599，表明两者亲缘关系最远。

2.4 聚类分析结果

利用18对具有多态性的SSR引物对96份藜麦材料的遗传结构进行分析。采用类平均法(UPGMA)聚类分析，得到96个藜麦种质资源聚类分析结果详见图7。在遗传相似系数为0.752处可将96个藜麦品种分为五类。第一类聚集了来自不同地区的63份藜麦材料，表明这些藜麦材料遗传亲缘关系比较近，其中LM 01-2-2与LQ 31-1的亲缘关系非常接近。当遗传相似系数为0.78时，第一类又可划分为七大亚类，第一大亚类包括40份藜麦材料，其中亚类群里的材料包括15种选系及3种不详选系，以ZL 00026选系为主，其次为ZL 00040选系和ZL 00022选系，表明这一亚群里的其他选系可能与ZL 00026、ZL 00040和ZL 00022这3个选系的亲缘关系较近，因此该类亚群的藜麦材料遗传亲缘关系比较近；第二大亚类包括2份藜麦材料，分别为LM 11-3和LM 11 a，均属于ZL 00029选系，表明LM 11-3和LM 11 a的亲缘关系非常接近；第三大亚类包括2份藜麦材料，为LM 10-3-1和LM 04 a，分别属于ZL 00118选系和ZL 00041选系，表明LM 10-3-1和LM 04 a的亲缘关系比较接近；第四大亚类包括2份藜麦材料，为LM 01-2-2和LQ 31-1，分别属于ZL 00114选系和LQ 31选系，表明LM 01-2-2和LQ 31-1的亲缘关系比较接近；第五大亚类包括4份藜麦材料，属于ZL 00117选系和ZL 00118选系；第六大亚类包括6份藜麦材料，属于5种选系，以陇藜1号选系为主；第七大亚类包括7份藜麦材料，属于6种选系，以HJL 10-1选系为主。第二类包括来自不同地区的16份藜麦材料，主要属于5种选系，以ZL 00114选系为主，其次为ZL 00117选系和观赏藜选系，表明这一亚群里的材料的选系可能与ZL 00114选系、观赏藜选系和ZL 00117选系的亲缘关系较近，故该类材料的亲缘关系比较近，其中观赏藜HJL-1和观赏藜HJL-2的亲缘关系非常接近，极有可能是同一品种，而甘肃引藜-2与其他15份材料又分为不同的小亚类，表明甘肃引藜-2与其他15份材料间的亲缘关系相对较远。第三类包括来自不同地区的5份藜麦材料，当遗传相似系数为0.78时，又可划分为两大亚类，第一大亚类包括3份藜麦材料，以ZL 00038选系为主；第二大亚类包括2份藜麦材料(GoldenRoyal三色与ML 01)均产自秘鲁。第四类包括来自中国农科院的6份材料，表明这些藜麦材料遗传亲缘关系比较近，包括2种选系，ZL 00019选系、ZL 00024选系各3份。第五类包括来自中国农科院的6份藜麦材料，分别为LM 01-2-1、ZL 00026-1-1、LM 12-2、LM 12-3、LM 12 a和LM 11-2，其中以ZL 00028选系材料为主，同时ZL 00029、ZL 00026、ZL 00114选系材料各1份，同为ZL 00028选系的LM 12-2和LM 12-3的亲缘关系非常接近。当遗传相似系数为0.71时，前面所分五类中，第五类与其他四类又分为不同的两大类别，表明第五类与其他四类之间存在明显的遗传差异，这类中的6份藜麦品种与其他类别的亲缘关系差距大。

表1 SSR引物及等位位点数

3 讨 论

相关研究发现，藜麦的营养价值远高于其他粮食作物，其富含赖氨酸及所具有的特殊成分皂苷与类黄酮凸显出其在粮食作物中的地位优势，不但被FAO正式推荐为最适宜人类的完美“全营养食品”，在未来也将会是最具有潜力的农作物之一。但是，因为藜麦原产地的气候与海拔等因素的影响，很多地区对藜麦的推广、引种、栽培和育种存在一定的困难，与藜麦原产地环境条件相近的贵州也不例外。因此亟需通过对藜麦种质资源的遗传多样性分析，从而筛选和选育适合贵州地区生长的藜麦品种，为贵州广泛种植藜麦打下基础。

本研究通过SSR分子标记技术分析了藜麦种质资源的遗传多样性，并从26对多态性的SSR引物中检测出18对SSR引物能明显扩增出稳定的多态性条带，占比为69.3%。与陆敏佳等[18]用45对SSR引物进行扩增且只筛选出16对具有多态性的SSR引物(占29.7%)的结果相比，本研究藜麦种质资源间的SSR分子标记多态性相对较好。18对多态性SSR引物共检测出192个等位基因，引物等位基因在3～21个之间，平均每对引物等位基因为10.7个，这结果远高于陆敏佳等检测41份藜麦材料得出平均每对引物检测到8.7个等位基因的结果，一方面表明该96个藜麦品种的遗传多样性相对丰富，另一方面表明不同的SSR引物多态性具有一定差距。通过聚类结果图，在相关系数为0.752处可将96个藜麦品种分为五类，聚集成一大类的藜麦种质资源的亲缘关系比较近，其中最大的一类包括63份藜麦材料。通过SSR标记计算藜麦种质资源间遗传相似系数，实验得到96份藜麦材料遗传相似系数范围为0.559～0.980，平均值为0.789 5。其中，LM 13-2与LM 14-3遗传相似系数最高，为0.980，表明两者亲缘关系最近。而LM 03-3-2与LM 12 a间的遗传相似系数最低，为0.599，表明两者亲缘关系最远。

本研究通过对96份藜麦材料进行遗传多样性分析，计算不同藜麦种质资源的遗传相似系数，并加以聚类，一方面为筛选适合贵州地区种植的藜麦材料和藜麦在贵州有效推广、种植、应用提供直接的参考，另一方面也为下一步杂交创制藜麦遗传材料时亲本的选择提供理论依据。