黑皮冬瓜小孢子发育与花蕾形态建成的相关性研究

李智军， 谭铭喜， 曾 晶， 卢文佳

(1.广东金作农业科技有限公司， 广州 510640； 2.广东省农业科学院作物研究所， 广州 510640)

冬瓜(BenincasahispidaCogn.)是我国传统重要的菜药兼用型蔬菜之一，已有近2 000年的栽培历史，主要分布于华南、西南和长江流域等地，年种植面积超过20万hm2[1-2]。近年，有关冬瓜资源创新及杂种优势利用研究取得了很大进步，已培育出一批以黑皮冬瓜为主的杂交一代品种，满足了生产者和消费者的需求[3-5]。

当今，单倍体技术已成为多种作物育种的核心技术之一，其优势在于显著缩短育种年限，提高效率，降低成本，并且在遗传群体构建、基因功能鉴定、转基因研究和细胞学研究等方面具有重要应用价值，其中利用小孢子(花粉或花药)离体培养获得单倍体植株已在十字花科、茄科、葫芦科和禾本科等250多种植物上获得成功，推动了作物育种进程[6-8]。然而，迄今为止冬瓜育种仍然多采用传统常规育种技术，尚未见有关单倍体技术方面的研究报道。

研究表明，小孢子发育时期是成功诱导胚状体和获得单倍体植株的关键因子，多数物种以单核靠边期的小孢子为最佳[7-11]；另外，小孢子发育与花器外部形态相关，可以依据花器形态特征以及花蕾大小判断小孢子发育时期[12-16]。为了开展和建立冬瓜小孢子培养技术体系，本研究对4个黑皮冬瓜品种的小孢子发育进行细胞学观察，同时观测小孢子各发育时期对应的花蕾形态特征及外观指标，研究黑皮冬瓜小孢子发育时期与花蕾形态建成的相关性，以期通过花蕾形态特征或外观指标快速判定小孢子发育时期。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为4个黑皮冬瓜品种：黑老粗(F1，广东金作农业科技有限公司)，黑优大、铁柱168、铁心333(F1，广东省农业科学院蔬菜研究所)。2018年2月24日播种，3月29日定植于广东省农业科学院白云试验基地，畦面宽80 cm，单行种植，株距60 cm，每品种种植25～30株，按常规方法管理。

1.2 花蕾观测

在主蔓生长到25～30节时，于09：30—11：30时从每个品种主蔓采摘雄花蕾。由于黑皮冬瓜为雌雄异花植物，主蔓上每连续着生3～6朵雄花后着生1～2朵雌花，其着生节位因不同植株及生育环境而改变。因此，以当天开放的花朵(无论雌雄)作为起始点(开花节)，分别从开花节之上按顺序每节摘取4～6朵雄花蕾放入自封口塑料袋内，采样后立刻带回实验室置于4 ℃冰箱，当天用游标卡尺测量雄花蕾的蕾长、蕾径、萼长、瓣长，然后用镊子剥开花瓣，测量雄蕊直径，并记录花药颜色。

1.3 小孢子发育观察

用镊子拨开不同节位雄花蕾的花瓣，夹取少许花药置于载玻片上，滴加DAPI荧光染色液8～10 μL，轻轻挤压花药，散出花粉，取出杂物，涂抹5～10 s使花粉与染色液混合均匀，然后盖上盖玻片，染色0.5～1 h，用Olympus BX 51荧光显微镜在40倍或100倍物镜下观察拍照(MicroPublisher 5.0 RTV)。小孢子发育时期的确定：每个花蕾随机观察5～7个视野，以所有视野平均70%以上的小孢子处于同一时期判定为该时期，之后从每个节位花蕾的小孢子照片随机选取10个用Image-Pro Plus 7.0软件测量其直径。DAPI荧光染色液配制：先将DAPI荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液PBS，配成DAPI浓度30 μg·L-1、蔗糖浓度10%(w/v)的溶液A，然后配制含乙醇70%(v/v)、甘油30%(v/v)的溶液B，将溶液A和溶液B按体积等比混合摇匀。

1.4 数据分析

试验观测数据采用Excel及SPSS 17.0软件进行统计分析，品种间的差异显著性采用Duncan法进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 黑皮冬瓜小孢子发育过程

对4个黑皮冬瓜品种的小孢子发育过程进行了细胞学观察，尽管对应相同发育时期的小孢子大小在品种间具有显著性差异，但变化幅度并不大。供试4个品种的小孢子发育过程相同，可分为5个时期(图1，表1)。 1) 四分体时期：花粉母细胞经过减数分裂形成四分孢子，包裹于胼胝质壁中，四面体排列，核占比较大，直径25.8～31.8 μm(图1 A)。 2) 单核居中期：包围四分体的胼胝质消溶后，小孢子膨大成为单核花粉粒，核居细胞中央，并开始逐步缩小，直径31.5～34.7 μm(图1 B)。 3) 单核靠边期：花粉粒继续膨大，细胞内形成液泡，核凝聚移至细胞壁边缘，偶尔可见2核仁花粉粒，直径32.6～42.9 μm(图1 C，D)。 4) 单核有丝分裂期：花粉壁加厚，细胞核扩展、变长，进行有丝分裂，但仍处于花粉壁边缘，液泡消失，花粉粒直径38.6～45.2 μm(图1 E)。 5) 双核期：在双核早期细胞核分裂成1个生殖核与1个营养核，随后营养核向细胞质内扩散，至双核中期又聚集，期间生殖核逐渐浓缩，到了双核后期多数情况下营养核和生殖核均向花粉粒中央迁移，生殖核变长，呈短棒状，但未见分裂(图1 F～H)，处于此期的花粉粒平均直径44.5～54.5 μm。在成熟花粉散出几小时后，可观察到少数花粉粒的生殖核分裂成2个精核，形成三核花粉(图1 I)，成熟花粉粒的生殖核一旦进入花粉管很快就分离成2个精核(图1 J)。

2.2 小孢子发育时期与花蕾着生节位的关系

从表2可知，黑皮冬瓜小孢子的发育时期与花蕾所处的节位密切相关，节位越高小孢子发育时期越早。对应不同小孢子发育时期的节位因品种有所差异，其中黑优大、铁柱168和铁心333三个品种相同，其小孢子处于四分体时期、单核居中期、单核有丝分裂期以及单核靠边期的雄花蕾分别着生于开花节之上的第9、8、7、6节，而双核期的雄花蕾位于第1～5节。黑老粗的这种对应关系较其它3个品种各高1个节位。

表1 黑皮冬瓜处于不同发育期的小孢子大小

2.3 小孢子发育时期与花蕾形态的关系

4个黑皮冬瓜品种间，对应不同小孢子发育时期的雄花蕾形态指标存在显著性差异，但其形态建成过程和特征基本类似(图2，表2)。各时期的雄花蕾特征和形态指标如下： 1) 四分体时期：花萼开张，花萼和花瓣均呈绿色，花药黄绿色。蕾长0.33～0.39 cm，蕾径0.34～0.48 cm，萼长0.49～0.64 cm，瓣长0.26～0.35 cm，雄蕊直径0.24～0.33 cm，蕾长/蕾径0.82～1.06，萼长/瓣长1.72～2.19。 2) 单核居中期：花萼开张度增大，花萼和花瓣仍为绿色，花药浅绿或黄绿色。蕾长0.41～0.58 cm，蕾径0.48～0.53 cm，萼长0.69～0.88 cm，瓣长0.38～0.43 cm，雄蕊直径0.38～0.44 cm，蕾长/蕾径0.87～1.09，萼长/瓣长1.73～2.13。 3) 单核靠边期：花萼平展，花瓣开始显现黄色，花药浅黄色。蕾长0.54～0.76 cm，蕾径0.53～0.73 cm，萼长0.78～1.18 cm，瓣长0.49～0.60 cm，雄蕊直径0.39～0.53 cm，蕾长/蕾径0.99～1.06，萼长/瓣长1.68～1.97。 4) 单核有丝分裂期：此期的雄花蕾形态特征与单核靠边期的类似，只是花蕾稍大，蕾长0.86～1.00 cm，蕾径0.71～0.89 cm，萼长1.05～1.33 cm，瓣长0.68～0.86 cm，雄蕊直径0.53～0.64 cm，蕾长/蕾径1.09～1.30，萼长/瓣长1.53～1.79。 5) 双核期：花萼开展，多数外卷，花瓣黄色增多，花药浅黄色，平均蕾长1.25～3.55 cm，蕾径0.92～2.16 cm，萼长1.24～1.50 cm，瓣长0.99～3.17 cm，雄蕊直径0.62～1.19 cm，蕾长/蕾径1.32～1.73，萼长/瓣长0.48～1.31。

表2 黑皮冬瓜小孢子不同发育时期的花蕾形态

2.4 小孢子大小与雄花蕾形态指标的相关性分析

从图3可知，黑皮冬瓜雄花蕾的蕾长、蕾径、萼长、瓣长、雄蕊直径、蕾长/蕾径以及其小孢子直径与节位均为负相关关系，而萼长/瓣长与节位呈正相关关系。其中，蕾长、蕾径、瓣长、雄蕊直径与节位的关系为负指数式，表明花蕾形态建成越临近开花越快；而小孢子直径、萼长与节位的关系为二次多项式，说明小孢子膨大和萼片生长在早期较快，越到后期越慢。蕾长/蕾径、萼长/瓣长与节位的关系均为直线式，很显然黑皮冬瓜雄花蕾的花瓣纵向生长远快于蕾径的增长和萼片的生长。

从黑皮冬瓜雄花蕾形态指标与小孢子大小的关系分析，除萼长/瓣长与小孢子直径呈负直线相关关系外，其它花蕾形态指标与小孢子直径均为正相关关系(图4)。其中，雄花蕾的蕾长、蕾径、萼长、瓣长及雄蕊直径与小孢子直径的关系均为对数式，而蕾长/蕾径与小孢子直径的关系为直线式。这些结果同样揭示了黑皮冬瓜小孢子膨大与花蕾外观形态建成的关联性，而且在它们发育早期和后期的速度有所不同，前者是由快转慢，而后者则相反。

3 讨论与结论

经细胞学观察，4个黑皮冬瓜品种的小孢子发育过程完全相同。在花粉母细胞两次分裂之后，可将其划分为5个时期，即四分体时期、单核居中期、单核靠边期、单核有丝分裂期和双核期，这与至今对其它葫芦科植物，如葫芦[12]、甜瓜[14]、黄瓜[15]、南瓜[17]、西葫芦[18]等的研究结果一致。本试验对DAPI荧光染色法进行了改进，通过使用乙醇、甘油及蔗糖等增加花粉壁的透明度，不仅简化了操作步骤，而且染色效果得到了显著提高。利用该简化法染色黑皮冬瓜小孢子可清晰观察到每个时期的核分裂过程。与成熟花粉粒含有三核的十字花科植物等明显不同，黑皮冬瓜小孢子自单核有丝分裂之后直至花粉成熟散出之前均只能观察到2个核，但是根据对成熟花粉粒中的生殖核细微结构的观察以及生殖核进入花粉管后很快就可分离出2个精核这一现象，认为黑皮冬瓜成熟花粉粒中的生殖核已经分裂形成2个精核，但二者紧密粘合在一起，尚未分开。另外还观察到，黑皮冬瓜小孢子在单核靠边期出现2核仁的情况，这种特异现象在黄瓜[19]、苦瓜[20]、南瓜[21]、甜瓜[22]上均被观察到，可见这种小孢子多核仁情况是在葫芦科植物中普遍存在的现象。目前多数研究者认为，引起多核仁的原因与其花粉母细胞分裂期核仁融合不彻底有关，但具体形成机制至今仍然不清楚[19,21]。

在利用小孢子(花粉或花药)离体培养进行单倍体育种中，选择处于单核靠边期的小孢子是成功诱导胚状体进而获得单倍体植株或DH系的关键[6-7]。由于小孢子处于花药之中，而花药是花蕾的一个花器，本质上两者具有内在的联系。因此，一些研究者对小孢子的发育与花蕾的形态特征的相关性进行了研究，证实从花蕾的形态特征或外观指标可以判定小孢子的发育阶段，只是不同作物判定小孢子发育时期的花蕾形态指标各不同[12-16]。王朝阳等[18]报道，西葫芦小孢子发育时期与花蕾纵、横径长度的关系在不同位次间存在一致性，在开花后的前7个位次上，任何一朵雄花都可以花蕾纵径长度或横径长度为标准判断小孢子的发育时期。王震[23]同样在西葫芦上也得出类似的结果。本研究表明，黑皮冬瓜小孢子大小与开花节之上的节次、花蕾形态指标存在密切的相关性，其相关性因花蕾指标不同表现形式有所差异，其中小孢子大小与雄花蕾的蕾长、蕾径、萼长、瓣长以及雄蕊直径呈对数式的正相关关系，与蕾长/蕾径为直线式正相关，而与萼长/瓣为直线式负相关。事实上，黑皮冬瓜植株在5—6月生长季节生长较为匀速，每1～2 d就可开放一朵花，而且随着开花在其之上的花蕾大小及形态特征保持相对稳定，而且同一节位雄花蕾中的小孢子也处于相同的发育时期，即着生于开花节之上相同节次的雄花蕾存在一致性。因此，黑皮冬瓜在这段植株生长相对稳定时期可以依据开花节之上的节次、雄花蕾的特征以及外观各项指标来综合判定小孢子的发育时期。经对黑皮冬瓜4个品种的观测，黑皮冬瓜小孢子处于单核靠边期的雄花蕾特征为：花萼平展，花瓣开始显现黄色，花药浅黄色，蕾长与蕾径大致相等(蕾长0.54～0.76 cm，蕾径0.53～0.73 cm)，萼长约为瓣长的1.8倍(萼长0.78～1.18 cm，瓣长0.58～0.60 cm)，雄蕊直径0.39～0.49 cm，着生于主蔓开花节之上的第7～8节。

然而，与多数植物一样，黑皮冬瓜的生长发育容易受到气温、光照以及土壤肥力条件等因子的影响，而且一旦主蔓结的瓜开始快速膨大，植株生长会明显受到抑制而减慢，表现为节间短缩，相邻节位花蕾的大小差异增大，处于开花节之上同等节位的花蕾越来越小，这可能会使小孢子发育时期与花蕾形态指标以及着生节位的上述关系发生偏差。因此，有必要进一步在不同季节或生育条件下研究黑皮冬瓜小孢子发育时期与节位、花蕾形态指标的相关性变化，以便获得更多的数据来精确判定小孢子发育时期。