杜仲EuGT2基因的克隆及表达分析

汪 锋， 王 超， 赵懿琛

(1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院， 贵阳 550025；2.贵州大学茶学院， 贵阳 550025； 3.贵州省农业科学院， 贵阳 550006)

杜仲(Eucommiaulmoides)是我国特有的单科、单属、单种的古老孑遗植物，素有植物“活化石”之称[1-2]。杜仲也是我国一种名贵的中药材，通常以皮入药[3]，药用成分主要包括苯丙素类(phenylpropanoids)、环烯醚萜类(iridoids)、木脂素类(lignans)等化合物[4-5]，其中，木脂素及其衍生物因具有较强的生理活性。研究表明，木脂素及其衍生物的高活性与植物细胞内糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)介导的木脂素糖基化密不可分[6-7]，而GT是一类催化受体分子进行糖基化修饰的酶[8]。该酶通常可以核苷酸活化的糖为糖基供体，特异性识别糖基受体，并在特定位点上催化糖苷键的形成，是植物次生代谢过程中一类重要的结构修饰酶[9]，调节植物体内的多种生理功能[10-11]。因此，研究植物中糖基转移酶基因的功能对进一步了解GT蛋白在植物代谢及对植物细胞响应胞内外适应性的调节等具有十分重要的意义。本研究以杜仲为材料，利用同源克隆从杜仲cDNA中克隆EuGT2基因，利用生物信息学分析预测杜仲GT蛋白功能，同时对该基因的表达模式进行分析，为深入研究和探讨杜仲糖基转移酶在杜仲生长发育过程及应答外界环境中的功能和作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

杜仲来源于贵州大学农业生物工程研究院的杜仲种植园，E.coliDH 5α菌株保存于贵州大学农业生物工程研究院实验室。植物总RNA提取试剂盒Fruit-mateTMfor RNA purification、RNAiso Plus、限制性核酸内切酶KpnⅠ、限制性核酸内切酶XbaⅠ、IPTG、pMD 20-T Vector、TaqDNA Polymerase、感受态细胞制备试剂盒均购于Takara公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit购自ABI公司；PlatinumTagDNA Ploymerase High Fidelity购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇均购买于上海生工生物工程有限公司；胰蛋白栋、酵母提取物、蔗糖、琼脂粉购于Sigma公司；NaCl购自成都金山化学试剂有限公司；卡那霉素、氨苄西林均购自北京索莱宝科技有限公司；引物合成于华大基因。

1.2 EuGT2基因的克隆、鉴定及测序

采用Fruit-mateTMfor RNA purification提取试剂盒并按照说明书提取杜仲总RNA，参照ABI公司High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit说明书合成cDNA。根据前期构建的杜仲转录组数据库设计同源克隆引物：F：5′-TCTAGAATGGCCTTTCTCGATGCGA-3′；R：5′-GGTACCCTACGTGGTGATGATGAAGTCCATCG-3′。根据合成的引物以及反转录生成的cDNA对EuGT2基因进行PCR扩增。扩增反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35 cycles；68 ℃ 5 min，4 ℃ forever。将PCR产物置于1.2%琼脂糖凝胶中分离，用OMEGA公司胶回收试剂盒进行回收，并将胶回后的目的片段与载体pMD 20-T Vector按照说明书进行连接，转化到E.coliDH 5 α感受态细胞中，然后用涂布棒均匀涂布在终浓度为100 mg·L-1的氨苄青霉素LB固体培养基上进行蓝白斑筛选，37 ℃过夜培养，挑取从蓝白斑板上选择白色菌落进行菌落PCR检测和双酶切验证，将鉴定后的阳性重组子送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序所得的结果与杜仲转录组数据库进行比对。

1.3 EuGT2基因的生物信息学分析

通过NCBI Conserve Domain Search工具对EuGT2基因的氨基酸序列进行分析，通过在线分析工具ProtParam对EuGT 2蛋白序列进行理化性质预测，利用CBS在线分析工具SignalP和TMHMM Server v 2.0对EuGT 2蛋白序列的信号肽、跨膜结构域进行预测，通过在线分析软件ProtScale对EuGT 2蛋白氨基酸序列的亲疏水性进行预测，分别用在线软件PSIPRED和Swiss-Model对EuGT 2蛋白的二级结构和三级结构进行分析预测和同源建模。Mega 5.0软件用于系统进化树分析。

1.4 EuGT2基因实时荧光定量分析

为研究EuGT2基因在杜仲不同生长发育时期、不同部位的表达情况，分别对杜仲成熟植株及杜仲幼苗的根、茎、叶进行RNA提取，并通过荧光定量PCR对EuGT2基因表达量进行分析，采用EuACTIN基因作为内参，使用SYBR®Select Master Mix(ThermoFisher Scientific)试剂盒进行荧光定量PCR，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，利用OriginPro 2018和SPSS软件将所得到的数据进行处理和显著性分析。反应程序如下：预变性94 ℃，3.0 min；变性94 ℃，10 s；退火60 ℃，30 s；延伸72 ℃，20 s；共40 cycles；保存12 ℃，∞。

2 结果与分析

2.1 EuGT2基因的克隆

以总RNA逆转录获得的cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，得到一条特异性条带，该片段大小在250～500 bp之间，胶回收目标片段，利用测序和拼接，获得EuGT2基因的全长CDS序列，EuGT2基因长285 bp，共编码94个氨基酸。

2.2 EuGT 2蛋白的生物信息学分析

2.2.1EuGT 2蛋白的氨基酸序列分析和结构预测

利用Translate(https://web.expasy.org/translate/)将EuGT2基因序列翻译成氨基酸序列(图2 A)，EuGT2基因共编码94个氨基酸。通过在线软件Predict Protein对EuGT 2蛋白二级结构特征进行分析，结果显示，EuGT 2蛋白二级结构中α-螺旋(alpha helix)占18.08%，延伸链(extended strand)占17.02%，无规则卷曲(random coil)占64.90%。使用在线软件Swiss-Model对EuGT 2蛋白的三级结构进行同源建模(图2 B)，EuGT 2蛋白与同源建模用到的模板分子(Xyloglucan 6-xylosyltransferase 1)的一致性为48.91%。

2.2.2EuGT 2蛋白信号肽和蛋白亲/疏水性预测

通过SignalP和TMHMM Server v 2.0对EuGT 2蛋白序列进行信号肽结构预测，结果显示，EuGT 2蛋白无信号肽(图3 A)。通过ProtScale对EuGT 2蛋白的亲/疏水性进行分析，结果显示，EuGT 2蛋白属于疏水性蛋白(图3 B)。

2.2.3EuGT 2蛋白的系统进化树构建

利用MEGA 5.0软件将EuGT 2蛋白的氨基酸序列与NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blastp的15条GT蛋白序列进行多重比对(图4)，发现杜仲EuGT 2蛋白在进化过程中与黄灯笼辣椒(Capsicumchinense)半乳甘露聚糖半乳糖基转移酶的亲缘关系较近。

2.3 EuGT2基因实时定量分析

为了研究EuGT2基因在植株不同时期、不同部位中的表达水平，分别对杜仲初生幼苗期和小苗期的根、茎和叶中的EuGT2基因的表达量进行测定。实验结果表明，EuGT2基因在初生幼苗期的根、茎、叶中的表达量无差异显著，EuGT2基因在杜仲小苗期的根、茎和叶中表达量均高于杜仲初生幼苗期，而在杜仲小苗期中茎的表达量最高，是根的2.8倍，是叶的5.5倍。

3 讨 论

糖基转移酶能够通过催化缩合反应形成糖苷键的形式，将供体的糖基连接到受体分子上，形成多糖分子和糖基化衍生物，在植物的各项生理功能中起重要调节作用。在植物体内，糖基转移酶的作用底物相当广泛[12]，如细胞内的重要代谢产物糖蛋白、糖脂等的糖基必须在糖基转移酶作用下才能合成[13]；纤维素、木质素和果胶等植物细胞壁组成成分的形成也离不开糖基转移酶的催化。Lim等[14]从拟南芥中成功克隆得到了糖基转移酶基因UGT72E2和UGT72E3，研究后发现UGT72E2和UGT72E3是糖基化木质素合成途径的重要前体物质，参与植物细胞壁的合成。Zhao等[15]从荔枝果实中也克隆得到了糖基转移酶基因UFGT3，并发现该基因参与了荔枝果实中花青素苷合成，且花青素苷的含量与UFGT3表达量呈正相关[15]。由此可见，糖基转移酶对植物体的生长发育起到了至关重要的作用，所以研究杜仲糖基转移酶基因，不仅可以进一步揭示糖基转移酶的功能，还可以为后续研究糖基转移酶在杜仲生长发育过程中发挥的作用提供一定科学依据与实验支持。

利用生物信息学的方法可从基因组或转录组数据中分离得到目的基因，并对其功能进行预测和分析[16]。本研究成功从杜仲中克隆得到了EuGT2基因，利用生物信息学对EuGT 2蛋白结构域进行预测，结果显示，EuGT 2蛋白质序列中存在1个GT家族所特有glyco tranf GTA结构域[17]，由此可推断EuGT 2蛋白属于GT家族蛋白。信号肽及跨膜结构分析结果显示，EuGT 2蛋白属于细胞质蛋白，与糖基转移酶催化糖基化反应的位置是一致的[18]。利用实时荧光定量PCR对杜仲初生幼苗期和小苗期的根、茎、叶中EuGT2基因的表达量进行分析发现，EuGT2基因在幼苗根、茎、叶中表达量均较低，且差异不明显；在成熟植株中，EuGT2基因的表达量与幼苗中的表达量相比存在显著性差异，而且EuGT2基因在杜仲成熟植株茎中的表达量最高，叶中的表达量最低。这一结果与陆军等[19]从巨桉中克隆得到糖基转移酶EgrGATL1的表达分析结果相近。推测原因可能为EuGT2和EgrGATL1作为GT家族的成员，可能参与了细胞壁中木质素的合成，由于杜仲幼苗的木质化程度较低，所以EuGT2基因在杜仲幼苗的不同部位的表达量均较低且差异不明显。成熟植株木质化程度较幼苗的高，因而EuGT2基因在成熟植株中的表达量较幼苗相比有显著性差异；在成熟植株中茎的木质化程度最高，其次是根，而叶的木质化程度最低，这也与EuGT2基因在茎、根、叶中的表达趋势相符合。由于现有的研究结果有限，关于EuGT2基因是否真正参与了杜仲植物细胞壁中木质素的合成，仍然需要进行大量的后续试验来证明，可以在本研究结果的基础上对杜仲幼苗和成熟组织的根茎叶进行木质素含量测定，从而进一步确定EuGT2基因的功能。