非创伤性双下肢缺血后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

顾迎春 于晓玲 郭维军 (淮阴医院心内科,江苏 淮阴 223300)

缺血性心脏病是心血管疾病的多发病与常见病,目前保护缺血心肌最有效的方法是再灌注,即血管再通术。然而随之带来的再灌注心律失常、代谢异常以及心肌超微结构的改变,即心肌的缺血再灌注损伤,直接影响病人的预后。多年来研究人员为减轻缺血再灌注损伤先后进行了缺血预处理、缺氧预处理、药物预处理等有效方法的研究,但因很难预测急性缺血事件的发生,预处理的临床应用受到限制。 2003年 Zhao等〔1〕首先提出缺血后处理(IPTC,经典后处理)并证实其与预处理有类似的保护效果,但经典后处理是一个附加的缺血干预,操作复杂有创,临床应用受限。而远程后处理操作简单易行,如能证实有效,临床上应用前景将更为广阔。本文旨在探讨在体情况下,经典后处理及远程缺血后处理对大鼠心肌缺血面积及超氧化物歧化酶(SOD)等的影响,为临床寻找心肌缺血事件发生后的心肌保护方法提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 模型制作与分组 健康雄性 SD大鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)40只,体重 250～300 g。大鼠用乌拉坦 1 g/kg麻醉,描记肢导心电图,气管插管,上呼吸机,分离左侧颈总动脉留用;沿左锁骨中线纵行切开皮肤,分别在 2、3、4肋间隙进针穿线,分开肋间隙和软组织,剪断肋骨,暴露心脏,以左冠状动脉主干为标志,在左心耳下缘 2～3 mm处进针,5/0丝线穿过,用一长约 5mm,直径 1.5 mm的乳胶管垫于血管与结扎线之间,打活结,以收紧结扎线时S-T段抬高。放松后S-T段下降1/2以上为模型成功,关闭胸腔。40只大鼠随机分四组,每组10只。①假手术组(空白组):开胸后穿线,不收紧扎线;②再灌注损伤组(I/R组):收紧结扎线,造成缺血 30 min;③IPTC组(后处理组):打活结结扎 30 min,再通 10 s,结扎 10 s重复 4次;④非创伤性双下肢缺血后处理组(远程组),操作同IR组,在再灌注同时捆绑双下肢 5 min,以不能触及股动脉搏动为准,松开 5 min,反复 3次,以上各组剪断结扎线后均再灌 180 min。

1.2 检测指标及方法

1.2.1 心律失常评分 记录缺血和再灌期间室早发生次数,室速、室颤发生率及累计持续时间。参照文献〔1〕进行评分,0分:无室性心律失常或仅发生室早,且 ＜5次 /min;1分:仅发生室早≥5次/min;2分:仅发生一阵室速且 ＜60 s;3分:发生一阵≥60 s的室速或发生多阵室速但累计时间≤60 s;4分:发生多阵室速且累计时间≥60s;5分:发生室颤但能够自动恢复;6分:出现不可恢复的室颤或在观察期内死亡。

1.2.2 心肌梗死范围测量 取血毕,原位结扎冠状动脉,1%伊文思蓝 2ml由主动脉逆行注入左心室,剔出心房和右室及蓝染区域,-20℃冰冻 20 min,取出后将心脏横切成 1～2 mm的短轴切片,放入 1%TTC 0.1 mmol/L磷酸缓冲液中(pH值7.4)中,37℃孵育 20 min。TTC染色后梗死心肌不染色,呈灰白色,缺血区心肌呈红色,分离后滤纸吸干,称重,梗死范围以坏死心肌重量与左室重量(坏死+非坏死)之比表示。

1.2.3 光镜下观察大鼠心肌形态改变 实验结束立即取下心脏,4%甲醛固定,从心尖始间距为 0.3cm横向连续切片,石蜡包埋切片(5μm厚),HE染色,光镜下观察病理改变。

1.2.4 血清生化指标测定 于 180 min再灌注末,颈总动脉取血 4ml,1 500 r/min离心 10min,取上清液,测定血中磷酸肌酸激酶(CK)、SOD、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)含量,各项均按试剂盒方法测定及计算。

1.3 统计学方法 全部数据分析采用SPSS11.5统计软件进行分析,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 心律失常评分比较 缺血期及再灌注期间后处理组、远程组心律失常评分明显高于空白组、I/R组,差异有显著统计学意义(P＜0.01),见表 1。

2.2 心肌梗死范围测量 空白组坏死区重量为 0 g;I/R组、后处理组、远程组三组间左室重量相当;远程组、后处理组梗死范围明显低于 I/R组(P＜0.01),见表 2。

2.3 光镜下观察大鼠心肌形态改变 空白组心肌纤维染色均匀、横纹清晰,心肌间质未见出血坏死及炎性细胞浸润;I/R组心肌组织有不同程度肿胀,心肌纤维断裂,间质有较多炎性细胞浸润,肌间质有瘀血;远程组与后处理组心肌细胞肿胀明显减轻,心肌纤维呈波浪状,肌浆分布不均匀,心肌间质无出血,有少量炎性细胞浸润,见图 1。

表1 各组心律失常评分比较(n=10,±s,分)

表1 各组心律失常评分比较(n=10,±s,分)

与空白组比较:1)P＜0.01;与 I/R组比较:2)P＜0.01

组别 缺血期 再灌注期空白组 0.2±0.42 0.1±0.32 I/R组 1.2±1.031) 2.7±1.771)后处理组 1.1±0.881) 1.4±0.971)2)远程组 1.0±0.661) 1.5±0.841)2)

2.4 血清生化指标测定 远程组及后处理组 CK、MDA含量明显低于 I/R组;SOD、NOS含量明显高于 I/R组,见表 3。

表2 大鼠梗死范围、左室重量的比较(n=8,±s)

表2 大鼠梗死范围、左室重量的比较(n=8,±s)

与 I/R组比较:1)P＜0.01

组别 坏死区(g)非坏死区(g)梗死范围(%)左室重量(g)I/R组 0.175 4±0.194 0.281 2±0.032 4 38.50±4.41 0.457 9±0.334后处理组 0.114 4±0.1011)0.354 8±0.2281) 22.59±1.751) 0.469 2±0.254远程组 0.121 7±0.0771)0.316 4±0.023 91)27.78±1.971) 0.438 1±0.136

表3 各组大鼠血清生化指标的比较(n=10,±s)

表3 各组大鼠血清生化指标的比较(n=10,±s)

与空白组比较:1)P＜0.01;与 I/R组比较:2)P＜0.05,3)P＜0.01

组别 CK(U/L) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) NO(μmol/ml) NOS(nmol/ml)空白组 38.29±11.94 75.7±6.90 4.07±0.95 102.06±18.71 45.24±6.37 I/R组 183.99±32.911) 38.53±5.871) 10.86±1.881) 63.12±10.201) 28.88±4.561)后处理组 98.98±18.571)3) 60.17±6.331)3) 8.94±1.811)2) 76.96±13.331)2) 38.14±6.041)3)远程组 121.36±21.541)3) 58.39±7.281)3) 9.38±2.291)2) 77.22±15.891)2) 35.91±7.631)3)

图1 各组心肌组织病理学观察(HE)

3 讨 论

本研究利用止血带所致的肢体缺血,进行非创伤性双下肢缺血后处理(N-W IPTC)对大鼠心肌I/R进行观察,结果提示,N-W IPTC组与IPTC组的实验大鼠心肌梗死组织重量百分比比较无显著性差异,而与I/R组比较,IPTC组和N-WIPTC组的大鼠心肌梗死组织重量百分比显著减小,表明和 IPTC的心肌保护作用一样,N-WIPTC也具有减少大鼠I/R心肌梗死面积的作用,推测其可能机制有:①反复捆绑和松开下肢,可刺激儿茶酚胺释放增加,与受体结合后激活 G蛋白和磷脂酶 C,随之活化蛋白激酶 C(PKC),上调热休克蛋白的转录而显示保护效应〔2〕,②下肢捆绑后导致局部缺血缺氧,刺激血管内皮细胞内 Ca2+浓度增加,使 NO合成酶活化,产生并释放 NO,NO可通过 cGMP含量增加而减少Ca2+内流或抑制心肌细胞内 Ca2+释放而发挥心肌保护作用,③下肢 I/R后处理过程中,局部缺血缺氧产生的氧自由基,产生与后处理相似作用,氧自由基在介导 IPTC心肌保护起着重要作用〔3,4〕。

上述研究表明,在体大鼠 N-W IPTC能够明显缩小心肌梗死面积,即远程缺血后处理同经典 IPTC一样对I/R心肌具有保护作用,其机制可能与减轻氧自由基损伤,抑制钙超载、保护血管内皮、减轻微血管损伤和炎症反应等作用有关〔5〕,但其保护心肌的确切机制尚有待进一步研究。

1 Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischernic postconditioning during reperfusion;comparision with ischernic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):579-88.

2 袁志柳,王艺明,沈 正,等 .非创伤性双下肢缺血后处理对大鼠 I/R心肌梗死面积和 PKCa表达的影响〔J〕.贵阳医学院学报,2006;31(3):238-40.

3 Pain T,Yang XM,Critz SD,et al.Opening of mitochondrial K(ATP)channels triggers the preconditioned state by generating free radicals〔J〕.Circ Res,2000;87(6):460-6.

4 Nakano A,Liu GS,Heusch G,et al.Exogenous nitric oxide can trigger a preconditioned statethrough a free radical mechanism,but endogenous nitric oxide is not a trigger of classical ischemic preconditioning〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2000;32(3):1159-67.

5 Tessier-Vetzel D,Tissier R,Waintraub X,et al.Isoflurane inhaled at the onset of reperfusion potentiates the cardioprotective effect of ischemic postconditioning through a NO-dependent mechanism〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2006;47(3):487-92.