组胺对老龄大鼠肠道细菌易位的影响

杨书良 郝玉栓 李校天 李兰梅 (河北工程大学医学院,河北 邯郸 056029)

生理情况下,肠道通过诸多屏障机制有效地防止肠道细菌及其毒素越过肠黏膜屏障,侵入肝、肾和肠系膜淋巴结等器官〔1〕。但在肠道感染时,肠黏膜屏障可受到损伤,引起肠道细菌易位〔2〕。 Walser等〔3〕报道,组胺受体阻断剂可降低肠黏膜屏障的保护作用,增加肠道细菌易位的发生。本实验旨在通过小剂量、低浓度组胺肠道内灌注,对肠道感染大鼠肠道细菌易位的影响来探索组胺对肠黏膜屏障是否有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 24月龄雄性 SD大鼠 30只,体重 260～270 g,购于河北医科大学实验动物中心,实验前进行适应性饲养 48 h,均未发现异常。组胺为 Sigma-Aldrich公司产品。大肠杆菌 O75购于上海 Harmony公司。

1 .2 方法

1.2.1 实验前准备 实验前 24 h取大肠杆菌 O75单菌落放入 20ml肉汤培养液中培养,24 h后离心 15 min(5 000 r/min)去上清,加生理盐水 10 ml,再离心去上清,重复 3次后,再加生理盐水 10ml,取其中 1ml菌液在分光光度计(波长 600 nm)监测下,加生理盐水稀释至吸光度为 0.4止,此时菌液的大肠杆菌浓度为 3×1011/L。组胺配制成 100 ng/ml浓度,遮光低温保存备用;戊巴比妥钠用蒸馏水配置成 1%浓度备用。

1.2.2 动物模型制备 30只大鼠称重、编号后,随机分为对照组、肠道感染组和肠道感染+组胺组,每组 10只。所有大鼠实验前 12h禁食,采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg),上腹部正中切口,在空肠上端插管接微泵。除对照组外,其他大鼠均从空肠上端灌注浓度 3×1011/L大肠杆菌液 0.4ml。菌液灌注后肠道感染 +组胺组大鼠立即用微泵向小肠内灌注100ng/ml组胺,灌注速度第 1小时 2 ml,以后 1.5 ml/h,灌注4 h,对照组和肠道感染组用同样方法向小肠内灌注等量的生理盐水,4 h后处死全部大鼠。以上操作均在无菌条件下进行。

1.2.3 细菌培养 在无菌条件下分别取出肝、肾和肠系膜淋巴结,称重后添加 10倍量生理盐水研磨成匀浆,各取 0.2ml匀浆均匀涂于普通营养琼脂培养基上放入 37℃温箱内培养,24 h后计算菌落数,并换算成每克组织含菌量(×105cfu/g)。每份标本均做两份培养。

2 结 果

对照组10只大鼠中,有 3只大鼠肝匀浆培养基有细菌生长、2只大鼠肾匀浆培养基有细菌生长,1只大鼠肠系膜淋巴结匀浆培养基有细菌生长;肠道感染组全部大鼠肝、肾和肠系膜淋巴结匀浆培养基均有细菌生长;对照组与肠道感染组各组织间含菌量两两比较,均呈显著性差异(P＜0.01),表明肠道感染大鼠模型可靠。肠道感染 +组胺组 10只大鼠中,有 10只大鼠肝匀浆培养基有细菌生长、7只大鼠肾匀浆培养基有细菌生长,5只大鼠肠系膜淋巴结匀浆培养基有细菌生长;与对照组和肠道感染组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05)。见表 1。

表1 各组大鼠各组织细菌培养平均含菌量(×105 cfu/g,±s)

表1 各组大鼠各组织细菌培养平均含菌量(×105 cfu/g,±s)

与肠道感染组比较:1)P＜0.01,2)P＜0.05

组别 n 肝 肾 肠系膜淋巴结正常对照组 10 1.02±0.431)0.62±0.301)0.38±0.251)肠道感染组 10 8.35±3.27 7.16±3.18 5.68±2.86肠道感染 +组胺组 10 5.25±2.082)4.06±2.022)3.58±1.862)

3 讨 论

肠黏膜屏障是机体抵御外来病原微生物入侵的第一道防线。生理情况下,肠道通过肠黏膜上皮细胞及周围紧密连接构成的上皮屏障;黏膜表面的黏液及不移动水层构成的黏液屏障;正常微生物群构成的生物屏障;肠黏膜免疫系统中各种免疫细胞以及它们所产生的免疫球蛋白、淋巴因子构成的免疫屏障;肠腔内胃酸、胆汁及各种消化酶、激素等构成的化学屏障来维持肠黏膜屏障的功能完整,以有效地防止病原微生物及毒素通过肠黏膜侵入机体〔1〕。但是,在严重创伤、全身及肠道严重感染、缺血及缺血-再灌注、营养障碍及全胃肠外营养、肠道内微生态失调、休克等情况下,可引起肠黏膜屏障损伤。肠道内原籍菌或外来菌以及它们的毒素就可突破肠黏膜屏障引起细菌易位〔4〕。正常情况下,肠道细菌也可通过门静脉到达肝、肠淋巴系统到肠系膜淋巴结,但很少有肠道细菌通过血液循环到达肾。陈吉等〔5〕报道肠系膜淋巴结有 5%～10%的概率可以检测到肠道细菌,这种自发性细菌易位,可能是机体全身免疫应答反应调节过程中的一种重要刺激源。杨书良等〔6〕报道 10月龄正常大鼠肝、肠系膜淋巴结组织中可见少量肠道细菌易位,肾组织中未发现肠道细菌易位。本实验除发现老龄大鼠肝、肠系膜淋巴结组织中有少量肠道细菌易位外,肾组织中也发现了少量肠道细菌易位,这可能与老龄大鼠全身组织器官萎缩,肠黏膜各种屏障功能减弱有关。分泌型IgA(sIgA)是人类肠黏膜免疫屏障的主要抗体,它与多种疾病的发生、发展密切相关,特别和肠道感染、慢性鼻窦炎、呼吸道感染、泌尿生殖系统感染等关系密切。sIgA在肠黏膜局部免疫中发挥着重要作用,它们占据着黏膜表面,阻止细菌在肠黏膜表面停留、黏着、形成菌落〔7〕;可以和抗原结合形成大分子的复合物,阻止其进入细胞内;sIgA作为调理素与抗原结合,使细菌等微生物发生调理素化,增加黏膜表面单核巨噬细胞、中性粒细胞的表面吞噬作用;sIgA还能在小肠内结合和阻挡没有经过消化的大分子蛋白质穿过肠黏膜,避免引起机体的变态反应〔8〕。

组胺是一种作用广泛的单胺类物质,是肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒的标志物,在胃肠道的含量尤为丰富。它可通过其 H1R、H2R、H3R、H4R4种受体参与多种生理功能调节,如胃肠分泌与蠕动、神经内分泌调节、免疫反应调节等。小剂量的组胺进入肠道后,可激活肠道中的肥大细胞使其脱颗粒释放组胺,释放的组胺又可激活邻近的肥大细胞脱颗粒,形成自身放大机制进行调节〔9〕。老龄大鼠各种组织和器官都会出现不同程度的萎缩、功能下降,特别是免疫系统的功能下降明显。席丰等〔10〕研究证明,小剂量组胺肠道灌注后可增加老龄大鼠肠黏膜对 sIgA的分泌,增强肠黏膜免疫屏障的保护作用。

大肠杆菌 O75进入小肠后,可在肠黏膜表面大量生长繁殖,导致肠黏膜上皮细胞变性、坏死,肠黏膜屏障受损,肠道内的细菌即可突破肠黏膜屏障进入门静脉、肠淋巴系统引起肠道细菌易位。本实验肠道感染组大鼠肝、肾、肠系膜淋巴结匀浆培养均有大量细菌生长,而肠道感染加组胺治疗组肝、肾、肠系膜淋巴结匀浆培养细菌明显减少,可能是因为组胺通过以下机制对肠黏膜屏障进行保护:①组胺具有扩张细小动脉改善肠道血液循环;②促进液体的渗出和白细胞的趋化作用,渗出液中的免疫球蛋白、补体、杀菌肽、溶菌酶、纤维素等,可中和毒素、杀灭细菌及增加白细胞的吞噬功能〔11〕;③促进肠蠕动、减少致病菌在肠道中停留的时间;④促进胃酸、胆汁和各种消化酶的分泌,抑制致病菌的生长;⑤促进黏液分泌维持肠道内正常微生态;⑥激活抗原提呈细胞,增强其提呈抗原、合成促炎细胞因子〔12〕参与细胞免疫和体液免疫〔13〕。

本研究提示,肠道感染时小剂量组胺肠内灌注,有减轻老龄大鼠肠黏膜屏障损伤、保护肠黏膜屏障、阻止肠道细菌易位的作用。

1 杨书良,李兰梅,陈育民 .肠黏膜屏障的构成与功能研究进展〔J〕.临床荟萃,2008;23(24):1809-11.

2 Rhee KJ,Sethupathi P,Driks A,et al.Role of commensal bacteria in development of gut-associated lymphoid tissues and preimmune antibody repertoire〔J〕.J Immunol,2004;172(2):1118-24.

3 Walser EM,Nealon WH,Marroquin S,et al.Sterile fluid collections in acute pancreatitis:catheter drainage versus simple aspiration〔J〕.Cardiovasc Intervent Radiol,2006;29(1):102-7.

4 黎介寿.肠衰竭-概念:营养支持与肠黏膜屏障维护〔J〕.肠外与肠内营养,2004;11(1):65-7.

5 陈 吉,吴国豪.肠道细菌移位的研究进展〔J〕.肠外与肠内营养,2004;11(5):309-12.

6 杨书良,刘惠民,戴景芳等 .组胺对失血大鼠模型肠黏膜屏障的保护作用〔J〕.中国老年学杂志,2008;28(23):2303-5.

7 Lamm ME,Phillips-Quagliata JM.Origin and homing of intestinal IgA antibody-secreting cells〔J〕.JExp Med,2002;195(2):F5-6.

8 Golby SJ,Spencer J.Where do IgA plasma cells in the gut come from〔J〕?Gut,2002;51(2):150-1.

9 谢 华,何韶衡.组胺对肥大细胞激活的研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,2004;24(3):168.

10 席 丰,高金生,杨书良.组胺对老龄大鼠肠黏膜分泌型 IgA分泌调节的影响〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(22):2891-92.

11 吕艳青,栗原博.组胺在机体免疫反应中的作用〔J〕.中国药理学通报,2007;23(1):13-5.

12 Takahashi HK,Iwagaki H,Mori S,et al.Histamine inhibits lipopolysaccharide-induced interleukin IL-18 production in human monocytes〔J〕.Clin Immunol,2004;112(1):30-4.

13 Mazzoni A,Young HA,Spitzer JH,et al.Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells,resulting in altered T cell polarization〔J〕.JClin Invest,2001;108(12):1865-73.