三七总皂甙对脂肪变性 L02肝细胞甘油三酯含量及解耦联蛋白 2 mRNA表达的影响

张玉佩 杨钦河 孔怡琳 谢 芳 杨环文 程少冰 冯高飞

(暨南大学医学院中医系,广东 广州 510632)

解耦联蛋白(Uncoupling Proteins,UCPs)是一种哺乳动物特有的、在褐色脂肪组织中特异表达的线粒体内膜蛋白质,具有调节质子跨膜转运的作用。目前共发现 5种不同的UCP家族成员,分 别为 UCP1、UCP2、UCP3、UCP4 和 UCP5〔1〕。 其中UCP2具有调节脂质代谢的作用,并受脂质的反馈调节,从而抑制肥胖或脂质代谢障碍时脂质在肝脏沉积,阻止肝细胞脂肪变性,在脂肪肝的发生过程中起重要作用〔2,3〕。三七总皂甙(PNS)为中药三七提取的有效活性成分,其主要成分为人参皂甙 Rb1、人参皂甙 Rg1、三七皂甙 R1等,具有显著的降脂、抗脂质过氧化、抗纤维化、改善微循环、保肝、调节机体免疫力等作用〔4～6〕。本实验从体外途径建立肝细胞的脂肪变性模型,通过观察 PNS对脂肪变性 L02肝细胞甘油三酯(TG)含量及 UCP2 mRNA表达的影响,探讨其对脂肪变性肝细胞的降脂调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 L02肝细胞株购自中山大学实验动物中心细胞库,PNS标准品(编号:870-200001)购自中国药品生物制品检定所,小牛血清购自北京普博欣生物科技有限公司,RPMI1640干粉、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、台盼蓝均为美国 Sigma公司产品,油红 O染色试剂盒购自厦门信道生物技术有限公司,RNA提取试剂 TRIZOL、RT-PCR试剂盒均为日本 TAKARA公司产品,UCP2、β-actin引物均为上海英骏生物技术有限公司合成。美国Thermo公司CO2恒温培养箱、美国Thermo公司超速低温离心机,奥地利 TECAN公司 Tecan-safire2全波长多功能酶标仪,宁波新芝生物科技股份有限公司 JY96-Ⅱ超声细胞粉碎机,日本日立公司全自动生化分析仪,德国Leica公司 DMI 4000B倒置荧光显微镜,美国 BIO-RAD公司梯度 PCR仪、凝胶成像系统分析仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 L02肝细胞株常规培养于含 10%小牛血清的 RPMI 1640培养基中,培养条件为37℃,CO2浓度为 5%。根据细胞生长情况,待细胞长至瓶壁 80% ～90%(约每2～3 d),用胰蛋白酶消化收集细胞并传代。

1.2.2 肝细胞脂肪变性模型的建立 将处于对数生长期的L02肝细胞接种于 6孔培养板中,在 37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁 48h后,更换新鲜培养液,参考范建高造模方法〔4〕改进,予含 50%小牛血清的 RPMI 1640培养基孵育 L02肝细胞48 h,油红O染色鉴定。镜下见较多橘红色脂滴,表示肝细胞脂肪变性模型成功建立〔5〕。见图 1。

1.2.3 MTT法测定PNS对脂肪变性肝细胞增殖活力的影响将处于对数生长期的L02肝细胞,接种于 96孔板中,共种 2块板(预留空白孔用于调零)。常规培养 48 h,弃去培养基,加入造模培养基(含 50%小牛血清的 1640培养基)培养 48 h后,弃去培养基。分组处理(每板每组均设 4复孔):空白组(即只含培养液的调零孔),对照组(予 10%小牛血清的 1640培养基),PNS各剂量治疗组(分别予含 PNS 1、5、10、50、100、150和200μg/ml的 10%小牛血清培养基),培养 24 h后,每孔加入20μl MTT液(5mg/ml)继续培养。4 h后,小心吸弃孔内培养上清液,加入 150μl每孔的 DMSO,振荡 10 min,使结晶物充分溶解。以空白孔调零,通过全波长多功能酶标仪在波长570nm处测出各孔 OD值,并计算细胞存活率。存活率=(用药组OD值 -空白组 OD值)/(对照组 OD值 -空白组 OD值)×100%。与对照组比较,PNS在 0～50μg/ml范围内对脂肪变性 L02肝细胞增殖活力无显著影响(P＞0.05,见表 1),说明PNS在这个浓度范围内,对脂肪变性 L02肝细胞无毒性,故选取 PNS 10μg/ml作为低剂量治疗组,50μg/ml作为高剂量治疗组。

1.2.4 实验分组 实验分为正常肝细胞组,肝细胞脂肪变性模型组,自然恢复组,PNS低剂量组(10μg/ml),PNS高剂量组(50μg/ml)。除模型组继续予含 50%小牛血清的 1640培养基培养外,余组均改予含 10%小牛血清的 1640培养基培养。继续孵育 24h后,检测相应指标。

1.2.5 油红O染色观察肝细胞内脂滴变化 吸弃培养孔中的培养基,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤 3遍,4%多聚甲醛固定10 min,油红 O染液闭光染色 20 min,60%异丙醇冲洗 30 s,蒸馏水洗 30 s至背景透明,将培养板放置于倒置荧光显微镜下,采用 Leica Qwin plus系统(普通光)拍照。

1.2.6 肝细胞内甘油三酯(TG)含量的测定 吸弃培养孔中的培养基,PBS洗涤细胞 2遍,加入胰酶消化细胞,含 10%小牛血清的 RPMI1640培养基终止消化,并吹打细胞(确保将各孔内的所有细胞吹下),将各孔中的细胞悬液分别移入 1.5 ml离心管中,离心(4℃,1 000 r/min,5 min),弃上清;PBS洗涤细胞2遍,离心(4℃,1 000 r/min,5 min),弃上清;将微量离心管(EP管)置于冰上,每管各加入异丙醇 300μl;用超声细胞粉碎机裂解细胞 2 min;裂解后,离心(4℃,3 000 r/min,5 min),取上清,全自动生化仪检测上清中的TG含量。

1.2.7 肝细胞内UCP2 mRNA的表达 将培养板中的培养液弃去,PBS洗涤细胞 2遍,各孔加入 1 ml Trizol,吹打细胞,按Trizol试剂说明书操作,提取细胞总 RNA,电泳分析其完整性,测纯度,定量,-20℃冰箱保存备用。逆转录反应条件:30℃10 min,42℃ 20min,99℃ 5 min,4℃ 5 min(按 RT试剂盒说明书操作),反应完成后,取出瞬间离心,置 -20℃冰箱保存。引物采用 Primer5.0软件系统设计和分析。UCP2引物:上游 5′-GACCTA TGA CCT CAT CAA GG-3′,下游 5′-ATA GGT GAC GAA CAT CAC CAC G-3′,扩增片段长度 290 bp;β-actin引物:上游 5′-CCT GTA CGC CAA CAC AGT GC-3′,下游 5′-ATA CTC CTG CTT GCT GAT CC-3′,扩增片段长度 323 bp。扩增条件:95℃预变性 5 min,94℃变性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸1 min,35个循环,于 72℃再延伸 10 min。PCR扩增产物在同一张 1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,50 V恒压电泳 1 h,凝胶图像分析系统照相并对电泳条带进行分析,UCP2 mRNA相对表达量以其扩增带吸光度值与内参照扩增带吸光度值的比值表示。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析。

2 结 果

图1 肝细胞脂肪变性 48 h模型(油红 O染色,×400)

2.1 油红O染色各组肝细胞内脂滴变化情况 正常组:细胞边缘清晰,细胞内仅见少量橘红色脂滴;模型组:细胞明显肿大,轮廓模糊,细胞内可见较多橘红色脂滴,并出现脂滴融合现象;自然恢复组:细胞边缘模糊,细胞内均可见较多橘红色脂滴,但比模型组少;PNS低剂量组和PNS高剂量组:细胞边缘模糊,细胞内可见少量橘红色脂滴,较自然恢复组少。见图 2。

2.2 各组肝细胞内 TG含量的变化情况 与正常组比较,模型组的肝细胞内 TG含量明显增高(P＜0.01);与模型组比较,自然恢复组肝细胞内 TG含量明显减少(P＜0.01),但仍与正常组有差异(P＜0.01);与自然恢复组比较,治疗 24 h后,PNS各治疗组肝细胞内 TG含量均明显减少(P＜0.05),以低剂量组下降更为显著(P＜0.01)。见表 2。

表1 PNS各剂量组对脂肪变性肝细胞增殖活力的影响(±s,n=4)

表1 PNS各剂量组对脂肪变性肝细胞增殖活力的影响(±s,n=4)

与对照组比较:1)P＜0.01

组别 OD值 存活率(%)对照组 1.177±0.014 100.0 PNS 1μg/ml 1.156±0.103 98.2 PNS 5μg/ml 1.143±0.052 97.1 PNS 10μg/ml 1.083±0.074 92.0 PNS 50μg/ml 1.051±0.024 89.2 PNS 100μg/ml 1.019±0.0661) 86.6 PNS 150μg/ml 1.007±0.0921) 85.5 PNS 200μg/ml 0.928±0.0971) 78.8

2.3 各组肝细胞 UCP2 mRNA表达水平 各组肝细胞 UCP2 mRNA均有不同程度的表达,模型组表达最高,与正常组比较有显著差异(P＜0.01);与模型组比较,自然恢复组 UCP2 mRNA表达量略有下降,但无显著差异(P＞0.05);与自然恢复组比较,PNS各治疗组 UCP2 mRNA表达量均有不同程度下调,其中高剂量组下调有显著性差异(P＜0.05)。见表 2,图 3。

表2 各组肝细胞内 TG含量及UCP2m RNA的表达(±s)

表2 各组肝细胞内 TG含量及UCP2m RNA的表达(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01;与自然恢复组比较:3)P＜0.01,4)P＜0.05

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图2 PNS治疗 24h后各组肝细胞内脂滴的变化(油红 O染色,×400)

图3 各组肝细胞UCP2 mRNA表达

3 讨 论

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种遗传-环境-代谢-应激相关性肝脏疾病,其发病与肥胖、糖尿病、营养不良、药物中毒、感染、缺氧等因素有关,其中过量高脂饮食是引起 NAFLD发生的最常见因素,脂质代谢紊乱导致肝细胞内脂质过度蓄积(主要为TG)是形成NAFLD的先决条件〔7〕。UCP2是位于肝细胞线粒体内膜上的载体蛋白,属于 UCP家族的一员,与 NAFLD的发生、发展密切相关。研究发现〔8〕正常肝细胞 UCP2一般不表达或少量表达,但伴有脂肪肝的ob/ob小鼠肝细胞,以及用脂肪乳培养的正常小鼠肝细胞均有UCP2高表达,说明肝细胞UCP2可能是一种可诱导的基因,增强的UCP2可能进一步调节其靶位基因包括与TG和磷脂合成相关的基因及与多不饱和脂肪酸合成相关的基因等,从而使肝细胞内脂质聚集,引起肝细胞发生脂肪变性。中药三七具有活血化瘀之功效,临床上发现其具有降血脂,改善肝微循环障碍,护肝利胆等作用,因此本实验选择中药三七的主要活性成分(PNS)作为处理因素,观察其对脂肪变性肝细胞的降脂调控机制。

本实验采用 50%小牛血清诱导 L02肝细胞 48 h成功建立肝细胞脂肪变性模型。50%的小牛血清作为一种高营养物质,其在体外诱导的肝细胞脂肪变性模型与高营养饮食形成的NAFLD病理过程在诱因和致病环节上有着相似之处。实验结果显示:正常肝细胞 TG含量和UCP2 mRNA表达很低,模型组肝细胞内 TG含量较正常组明显增高(P＜0.01),UCP2 mRNA表达明显增强(P＜0.01),油红O染色后可见模型组肝细胞内有较多橘红色脂滴,并出现脂滴融合现象,表明高浓度的小牛血清可引起肝细胞内脂质发生蓄积,究其原因可能与肝细胞对高营养物质摄入增加引起脂质代谢发生紊乱、导致肝细胞对TG的合成增多、TG的转运和氧化功能出现障碍有关。

本实验观察 PNS对脂肪变性肝细胞 TG水平及 UCP2 mRNA表达的影响,结果显示:与自然恢复组比较,PNS各治疗组肝细胞内 TG含量明显减少,以低剂量组更为明显;PNS低剂量组 UCP2 mRNA有一定程度的下降,但以PNS高剂量组UCP2 mRNA的表达下降明显,提示PNS能明显降低脂肪变性肝细胞内 TG含量,下调 UCP2mRNA的表达,减轻肝细胞脂肪变性,其作用可能不存在明显的量效依赖关系,在一定剂量范围内,PNS对脂肪变性肝细胞的降脂作用可能是通过下调 UCP2 mRNA的表达而发挥药效作用。

本实验提示,脂质在肝细胞内的蓄积引起肝细胞脂肪变性可能与细胞内 UCP2 mRNA表达上调有关,PNS可能是通过下调 UCP2 mRNA的表达,降低脂肪变性肝细胞内 TG含量,从而改善肝细胞脂肪变性,其全部确切机制有待于进一步研究。

1 Rousset S,Alves-Guerra MC,Mozo J,et al.The biology of mitochondrial uncoupling proteins〔J〕.Diabetes,2004;53(1):130-5.

2 Chavin KD,Yang S,Lin HZ,et al.Obesity induces expression of uncoupling protein-2 in hepatocytes and promotesliver ATPdepletion〔J〕.JBiol Chem,1999;274(9):5692-700.

3 Jun HS,Kim IK,Lee HJ,et al.Effects of UCP2and UCP3 variants on the manifestation of overweight in Korean children〔J〕.Obesity,2009;17(2):355-62.

4 何 晶.三七的药理作用及研究进展〔J〕.天津药学,2004;16(5):58-60.

5 Cicero AF,Vitale G,Savino G,et al.Panax notoginseng(Burk)effects fibrinogen and lipid plasma level in ratsfed on a high-fat diet〔J〕.Phytother Res,2003;17(2):174-8.

6 Yuan ZB,Zhang HG,Jia Y,et al.Temporal expression of cyclooxygenase-2 in peritoneal macrophages of rats and effects of panax notoginseng saponins〔J〕.Inflamm Res,2009;58(2):74-80.

7 Cheung O,Sanyal AJ.Abnormalities of lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.Semin Liver Dis,2008;28(4):351-9.

8 Cortez-Pinto H,Zhi Lin H,Qi Yang S,et al.Lipids up-regulate uncoupling protein 2 expression in rat hepatocytes〔J〕.Gastroenterology,1999;116(5):1184-93.