油红O染色原代未活化胰腺星状细胞脂肪滴的实验观察

唐元瑜 水楠楠

（福建中医药大学中医学院，中医基础理论内经教研室，福州350108）

油红O为活性很强的脂溶性染料，在组织或细胞的脂质中高度溶解，与类脂有较强的亲和力，具有使脂肪组织或细胞内脂滴特异性着色的特性，常被广泛用于体内储脂细胞如原代未活化的肝、胰星状细胞和前脂肪细胞的染色鉴定。

研究表明：胰腺纤维化是和慢性胰腺炎、胰腺癌密切相关的一种病理变化，而胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSCs）则是胰腺纤维化发生的主要效应细胞［1］。在生理情况下，胰腺星状细胞处于静止未活化状态（quiescence），胞质内含有较丰富的维生素A和脂滴；病理状况下，多种刺激因子如炎性因子、酒精及其代谢产物、氧化应激等则可刺激其活化增殖，使细胞表型发生改变，转化为肌纤维母细胞，同时胞质内的脂肪滴逐渐减少，甚者消失［2，3］。本实验利用该细胞这一生物学特性，对原代培养的未活化胰腺星状细胞脂肪滴进行了染色鉴定，现将结果报道如下。

材料和方法

1．材料

油红O（AR，上海国药集团化学试剂有限公司，批号：WSIG201008032），异丙醇（AR，天津市致远化学试剂有限公司，批号：WSIG20101106），pH7．4磷酸盐缓冲液（由 NaCl 8．00g KCl 0．20g Na2HPO4·12H2O2．82g KH2PO40．20g组成），400g／L甲醛液（AR，西陇化工股份有限公司，批号：1103032）。电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：DK－S24），倒置生物显微镜（日本尼康公司，型号：Ti－S系列 ）。

2．方法

2．1原代小鼠胰腺星状细胞的分离与培养

参考国外学者Kruse［4］及本文作者建立的方法［5］，主要包括取胰、消化、植块培养等步骤。受试细胞选用原代培养4天的未活化胰腺星状细胞。

2．2油红O染液的配制

电子天平称取油红O粉末0．25g，放入50mL康宁螺口带盖的塑料锥形离心管中，添加异丙醇有机溶剂，定容至50mL，加盖，封口膜密封，置离心管于60℃电热恒温水浴箱中，加热溶解30min，中途颠倒摇晃2－3次以助溶，定性滤纸过滤，即得浓度为5g／L的饱和油红O母液。

临用时，取上述5g／L油红O母液，与蒸馏水按体积比6∶4在50mL康宁螺口带盖的塑料锥型离心管中混匀后，加盖静置30min，小心吸取上清，定性滤纸再次过滤，即得油红O工作染液。

2．3油红O染色原代小鼠胰星状细胞脂肪滴

主要包括漂洗、固定、浸染、脱色以及复染等步骤，即：用巴氏滴管吸取2mL37℃预热的磷酸盐缓冲液于接种有原代胰腺星状细胞的6孔板中，作十字形晃动，轻轻漂洗贴壁细胞2遍后，用滤纸吸尽孔中残存的磷酸盐缓冲液，加入1mL 100g／L甲醛液常温下固定15min，弃之，再次予磷酸盐缓冲液轻轻漂洗固定的细胞2遍，然后沿孔壁缓慢加入3mL新鲜配制的油红O工作液，加盖，封口膜密封，在倒置生物显微镜下开始作动态观察。

若镜下观察到脂肪滴颜色逐渐加深，呈鲜红的、大小不一的串珠样时，即可吸尽油红O染液终止染色，并用磷酸盐缓冲液小心漂洗2－3遍后，加入苏木素液淡染胞核30S，再次予磷酸盐缓冲液漂洗分化脱色，即可镜下显微成像。

结 果

1．胰腺星状细胞活化前后的形态学比较

在倒置生物显微镜×200倍视野下，未活化的胰腺星状细胞形态主要表现为胞核较大，呈卵圆形，核仁明显，细胞质粗糙，颗粒样物质充满其中，将细胞核围绕成“空泡样”的戒环状。活化的胰腺星状细胞则体积较大，扁平，伪足发达，成“星芒状”或“乌贼样”。（图1A，1B）

2．油红O染色未活化胰腺星状细胞脂肪滴的观察

未活化的胰腺星状细胞脂肪滴被油红O染成鲜艳的红色，大小不一的串珠样“油珠子”分散于胞质中，簇集成“环状”，呈戒环样包绕在细胞核周围。（图1C，1D）

讨 论

原代未活化的胰腺星状细胞是一类胞浆内含有天然荧光素维生素A和脂肪滴的特殊类型的储脂细胞，而油红O能高度溶解于脂肪中，与其有较好的亲和力。利用该细胞这一生物学特性，我们予5g／L油红O饱和液对其进行了染色和鉴定，观察到未活化的胰腺星状细胞脂肪滴被油红O染成鲜艳的红色，大小不一的串珠样“油珠子”分散于胞质中，簇集成“环状”，呈戒环样包绕在细胞核周围，从而证实了培养的原代胰腺星状细胞含有脂肪滴这一重要生物学特征。

在本次试验中，我们体会到：选择合适的受试细胞，把握好染色时间是进行油红染色原代未活化胰腺星状细胞实验的关键。对于该细胞脂滴染色的时间，我们一般选择在置块培养的4－5天时间进行，因为该时间点上细胞刚从组织块爬出，脂肪滴含量较多，容易着色，背景干净。此外，油红O的正确配制和洗脱也是降低背景，提高信噪比的关键。由于油红O难溶于水，易溶于异丙醇、乙醇等有机溶剂，0．5g油红O在100mL异丙醇溶液中即可达到饱和，所以临用前需采用过滤的方法除去不溶性的油红颗粒及杂质。为此，我们采用定性滤纸两次过滤结合自然沉降法，避免了染色时不溶性油红颗粒及杂质在背景的沉积。对于油红的漂洗，文献报道常常使用600g／L的异丙醇或乙醇进行分化脱色［6，7］，而我们则直接使用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗3遍，也同样达到了消除背景油红颜色的目的。此外，在染色过程中，加盖密封以避免异丙醇挥发；添加油红染液的量宜宁多勿少；苏木素复染前应小心吸取上清液以减少颗粒沉积，也都是降低背景，增加信噪比的重要措施。

由于油红O在胞浆中是以脂滴的三维立体形式存在，且大小不一，显微镜聚焦时，细胞的焦点与油红焦点可能不在一个层面上，所以细胞的显微成像摄影技术也是油红染色观察成功与否的重要措施之一。我们体会到脂滴的观察视野以×200放大倍数为最佳，同时配合显微镜的相差功能以及白平衡功能，即可获得理想的成像效果。

总之，采用油红O染色原代未活化的胰腺星状细胞脂肪滴，是鉴定该细胞的重要方法之一，其步骤简单，结果直观，重复性高，值得学习和借荐。

图 版 说 明

图1 胰腺星状细胞活化前后的形态学比较及油红O染色脂肪滴的观察．A：未活化的胰星状细胞（×200）；B：活化的胰星状细胞（×200）；C：油红染色未活化胰星状细胞（×100）；D：油红染色未活化胰星状细胞（×200）；E：苏木素衬染未过滤造成的兰黑色颗粒沉积；F：异丙醇挥发造成的红褐色颗粒沉积

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The comparison of morphology of pancreatic stellate cells which is activated and quiescent and Experimental observation of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O

A：pancreatic stellate cells unctivated（×200）；B：pancreatic stellate cells activated （× 200）； C：morphology of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O（×100）；D：morphology of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O（×200）；E：Dark blue particle deposition which is brought about by unfiltered Hematoxylin；F：Reddishbrown particle deposition which is brought about by Isopropanol volatile

［1］王兴鹏．胰腺星状细胞与胰腺纤维化．胰腺病学，2004，4（2）：72－75

［2］张汝玲，王兴鹏．慢性胰腺炎胰腺纤维化发生机制及抗纤维化治疗进展．胰腺病学，2001，1（1）：56－58

［3］余晓云，陈婕，侯晓华．胰腺星状细胞活化相关因子研究进展．世界华人消化杂志，2006，14（20）：2009－2013

［4］Kruse，Marie－Luise．Isolation，Long－term Culture and Characterization of Rat Pancreatic Fibroblastoid／Stellate Cells．Pancreas，2001，23（1）：49－54

［5］唐元瑜，苏式兵．小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定．世界华人消化杂志，2010，18（1）：28

［6］崔叶青，李嘉，刘爽等．油红O染色鉴定胰腺星状细胞．中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（5）：522－523

［7］田玉旺，李琳，李丽等．介绍一种改良的油红O脂肪染色法．中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16（6）：736