单克隆抗体ND－1－量子点荧光探针对大肠癌细胞的特异成像研究

王 蒴 方 瑾

（中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，医学细胞生物学教育部重点实验室，卫生部细胞生物学重点实验室，沈阳110001）

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率呈逐年上升趋势。早诊断、早治疗是提高大肠癌治愈率的关键。通过从分子水平对肿瘤相关标志物的高灵敏度检测，有助于肿瘤的诊断、治疗及预后判断［1－2］。LEA（large external antigen，LEA）是在大肠癌细胞表面表达的一种肿瘤相关抗原。相关研究表明，LEA的表达具有一定的组织特异性，即在正常组织、非大肠癌及低分化大肠癌组织中，几乎不表达或表达率很低，在中高分化大肠癌组织中高度表达，对其检测有助于实现大肠癌的早期诊断［3］。ND－1是利用杂交瘤技术制备的抗LEA的单克隆抗体，研究显示，该抗体可与表达有LEA的大肠癌细胞特异性结合［4］，有可能发展为有效的分子探针，实现大肠癌的特异性成像和检测。

量子点（Quantum dots，QDs）是一种新型的荧光染料，一般是由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素组成的纳米级半导体颗粒。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有的特点是激发光谱宽且连续，发射光谱窄且对称；荧光强度高，是普通荧光染料的10－20倍，检测的灵敏度高；抗光漂白能力强，适合长时、动态的生命过程的研究；利用发射波长位于红外区的量子点可以实现在活体动物体内深层组织的成像研究［5－8］。

研究采用共价偶联方式制备ND－1与量子点QD605的荧光探针，并通过条件优化获得最佳的偶联效率，采用该探针成功实现对大肠癌细胞的靶向识别和特异性成像。

材料和方法

1．材料

人大肠癌细胞系CCL187、人宫颈癌细胞系He－La、杂交瘤细胞株IC2为本室保存。BALB／c小鼠购于中国医科大学实验动物部。量子点（QD605）购于武汉珈源量子点技术公司。1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（1－Ethyl－3－（3－dimethyllaminopropyl）－carbodiie－hydrochlide，EDC）、N－羟 基 硫 代琥珀 酰 亚 胺 （N－Hydroxysulfosuccinimide sodium salt，NHS）、DAPI、降植烷购于 Sigma－Aldrich公司。

2．方法

2．1单克隆抗体ND－1的制备、纯化及鉴定

取6－8周龄纯系雌性BALB／c小鼠，腹腔内注射降植烷0．5ml／只进行体内免疫抑制反应，7日后等量注射第二次。一周后，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞IC2，细胞密度为1－2×106／ml，注射剂量为0．5ml／只，10－20日后陆续抽取腹水。收集的腹水经离心、透析后，HiTrap protein G柱亲和层析纯化，SDS－PAGE电泳测定抗体纯度，Bradford法测定抗体浓度，并将抗体浓度调整至1mg／ml，4℃保存、备用。以纯化后ND－1为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗孵育人大肠癌细胞CCL187，荧光显微镜下检测单克隆抗体ND－1的免疫活性。

2．2量子点荧光探针ND－1－QD605的制备及条件优化

取一定量的 QD605，分别加入0．1mol／L EDC和0．01mol／L NHS，摇动反应15min，超滤后即为量子点活化液。取100μl量子点活化液，分别加入不同量ND－1，摇动反应90min后，10000rpm离心2min，上清液即为偶联产物ND－1－QD605。本研究分别在量子点：抗体蛋白摩尔比为1∶20，1∶40，1∶80条件下进行偶联，反应产物经0．5%琼脂糖凝胶电泳检测，通过电泳条带分析，确定偶联的最佳条件。

2．3ND－1－QD605荧光特性检测

2．3．1ND－1－QD605激发光谱和发射光谱

分别取400μl ND－1－QD605溶液和游离量子点QD605，利用荧光分光光度计扫描各自的激发光谱，扫描范围200nm－800nm；再以扫描得到的最大激发波长为激发光，扫描偶联产物与游离量子点发射光谱，扫描范围400nm－800nm。

2．3．2ND－1－QD605抗光漂白能力检测

取400μl ND－1－QD605溶液置于荧光分光光度计样品室内，用488nm的激发光持续照射1h，实时测定其荧光强度，得到时间―荧光强度曲线，通过分析荧光强度的变化，考察ND－1－QD605的抗光漂白能力。

2．4ND－1－QD605对靶细胞 CCL187的特异性免疫荧光成像

取盖片培养的人大肠癌CCL187细胞，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛室温固定15min，PBS漂洗3次；滴加 ND－1－QD605，37℃湿盒孵育1h，PBS漂洗3次；DAPI避光染色5min，PBS漂洗3次，荧光显微镜下观察细胞的荧光信号。以PBS和游离量子点QD605替代ND－1－QD605孵育CCL187细胞为空白对照组，用ND－1－Q D605孵育LEA阴性表达的人宫颈癌HeLa细胞为阴性对照组。

结 果

1．单克隆抗体ND－1的制备、纯化及检测

纯化后的单克隆抗体ND－1经SDS－PAGE电泳检测，在55kD及25kD附近呈现清晰的两条带（图1），与IgG抗体的重链和轻链的理论分子量一致，经凝胶成像扫描显示，抗体纯度达到95%。免疫荧光检测结果显示（图2），ND－1能够与表达有LEA的CCL187细胞特异性结合，细胞表面呈现明显的绿色荧光。

2．ND－1－QD605制备及电泳检测

以不同摩尔比的游离量子点QD605和ND－1抗体混合制备ND－1－QD605。琼脂糖电泳结果如图3所示，二者比例为1：20时，电泳图中可见ND－1－QD605和游离量子点QD605两条带，提示反应体系中量子点过量；随着抗体蛋白比例的增加，QD605条带消失，同时ND－1－QD605条带迁移速率减慢，可能的原因是伴随抗体比例的增加，量子点偶联的蛋白分子数量增加，使偶联产物分子量增大［9］。考虑到偶联产物分子空间粒径过大不利于细胞表面抗原的标记，优化选取的偶联比例为1∶40。

3．ND－1－QD605荧光特性检测

对ND－1－QD605和游离量子点QD605分别进行光谱扫描，结果如图4所示，偶联后的 ND－1－QD605的荧光激发光谱的范围较宽泛，在200nm－600nm范围内为能量吸收区域，与QD605相比，激发波长范围没有明显的改变（图4A）；发射光谱检测显示偶联产物保留了游离量子点在605nm处的特征发射峰，峰型对称（图4B）；同时，在被检测的量子点浓度相同的条件下，偶联产物的荧光强度明显高于游离量子点。

将ND－1－QD605溶液置于荧光分光光度计样品室内，用488nm激发光持续照射样品溶液进行抗光漂白实验，结果如图5所示，在持续激发照射1h内，ND－1－QD605溶液的荧光信号强度未发生明显改变。

4．ND－1－QD605对靶细胞CCL187的特异性免疫荧光成像

以ND－1－QD605孵育表达有LEA的CCL187细胞，DAPI对核复染，荧光显微镜下观察可见，CCL187细胞表面呈现明显的红色荧光，核复染显示红色荧光信号定位于细胞膜上（图6A、6B、6C）。在以PBS和游离量子点QD605代替ND－1－QD605的空白对照组，未见量子点荧光显像（图6D、6E、6F）；以 ND－1－QD605孵育LEA表达阴性的 HeLa细胞，也未见特异性成像（图6G、6H、6I）。

图6 ND－1－QD605标记CCL187细胞和 HeLa细胞的荧光图像（×100）A：ND－1－QD605标记CCL187细胞；B：DAPI染色示CCL187细胞核；C：A和B的合并图像；D：PBS和游离量子点QD605标记CCL187细胞；E：DAPI染色示CCL187细胞核；F：D和E的合并图像；G：ND－1－QD605标记HeLa细胞；H：DAPI染色示Hela细胞核；I：G和H的合并图像Fig．6Fluorescence images of CCL187cells and HeLa cells labeled with ND－1－QD605（×100）A：CCL187cells labeled by ND－1－QD605；B：CCL187cell nuclei stained with DAPI；C：Overlap images in A and B；D：CCL187cells labeled by PBS and free QD605；E：CCL187cell nuclei stained with DAPI；F：Overlap images in D and E；G：He－La cells labeled by ND－1－QD605；H：Hela cell Nuclei stained with DAPI；I：Overlap images in G and H

讨 论

研究将抗人大肠癌单克隆抗体ND－1与量子点共价偶联，成功制备可以特异性识别大肠癌细胞表面表达的LEA的荧光探针ND－1－QD605，并实现对大肠癌细胞的靶向荧光成像。荧光特性检测表明，与抗体蛋白共价偶联后，该荧光探针仍保留量子点优良的荧光特性，即较宽泛的激发谱线，较窄的发射谱线，非常强的抗光漂白能力。同时，免疫荧光标记结果显示，与量子点共价偶联后，该抗体蛋白仍具有与细胞表达的抗原的特异结合活性。这些结果表明，将量子点和单克隆抗体ND－1偶联后制备的荧光探针，能够很好地应用于大肠癌细胞特异的免疫荧光成像。

在对ND－1－QD605进行荧光光谱扫描时，我们发现，与游离量子点相比，偶联产物的荧光强度有所增加。量子点能够产生荧光的原因是当受到激发光照射时，其表面的电子从激发态回到基态，同时释放多余的能量，即产生荧光。在量子点制备过程中，会在量子点表面产生一种结构－－量子阱，它会吸收电子跃迁时产生的能量，降低量子点的荧光效率。当蛋白分子通过共价键连接在量子点表面后，可以对其表面结构进行修饰，减少量子阱结构的存在，从而提高量子点的荧光效率［10］。因此，量子点与抗体的偶联不仅可以实现量子点的靶向成像功能，还有可能在一定程度上提高基于量子点分析方法的检测灵敏度。

目前有关量子点免疫探针的制备主要基于两种策略，（1）非共价偶联方式。其中应用最多的是链霉亲和素－－生物素系统，即将生物素化抗体与链霉亲和素标记的量子点非共价偶联。其特点是操作简单易行，偶联反应的特异性强，偶联效率高，产物的稳定性好，可实现高灵敏度检测。但在活体标记研究中，要先在体外实现生物素化抗体与链霉亲和素标记分子的非共价连接，然后将偶联产物送入体内。通常，一分子链霉亲和素可以结合四分子的生物素，结果产生分子量很大的偶联产物，导致在体内组织间的渗透力较差，直接降低了标记效果［11］。所以，链霉亲和素－－生物素系统在体内应用尚存在一定的局限性。（2）共价偶联方式：即通过共价交联反应，使量子点和蛋白质分子间通过酰胺键形成复合物。虽然其偶联效率稍低于生物素反应系统，但由于抗体与量子点间结合牢固，因而在体内示踪、动态监测研究中更为有效。本研究为使偶联产物具有更为广泛的应用可能性，采用了EDC和NHS介导的共价偶联方式，实现了单克隆抗体ND－1与量子点的有效偶联，体外实验表明偶联产物具有特异性靶向结合能力和优良的荧光特性。

在共价偶联时，我们对量子点和抗体蛋白的摩尔比例进行了优化。有研究表明［9］，用量子点进行荧光标记时，量子点与蛋白分子间形成单价结合的偶联产物利于成像及信号检测。但在偶联反应中，一个量子点表面可以共价结合多个蛋白分子，其结果是结合在一个量子点上的蛋白分子越多，形成的量子点探针的空间粒径越大，由于空间位阻的存在，能够真正结合在抗原或者说细胞表面的探针数量反而在减少，从量子点荧光信号的角度来看，可以检测到的荧光信号在下降。因此，调整量子点与蛋白抗体的摩尔比例，实际上是调控一个量子点可以结合的蛋白分子数量，从而获得更好的特异性荧光成像。基于这一考虑，本研究在保证一定抗体－量子点偶联率的前提下，选取了抗体比例相对较低的偶联条件，获得了特异性强、灵敏度高的的靶向荧光图像，这为该量子点探针的实际应用及进一步进行体内靶向成像研究奠定了基础。

［1］Bystrom P，Berglund A，Nygren P，et al．Evaluation of predictive markers for patients with advanced colorectal cancer．Acta Oncol，2012，51（7）：849－859

［2］Imianitov EN．Molecular diagnostics in oncology．Vopor Onkol，2012，58（2）：153－163

［3］莫志成，宋今丹．肿瘤相关抗原LEA与CEA在大肠癌表达的对比研究．中国肿瘤临床，1999，26（7）：511－513

［4］Ronald B，Song JD，Elizabeth S，et al．Characterization of a new monoclonal antibody to a cell surface antigen on colorectal cancer and fetal gut tissues．Cancer，1986，57（3）：433－440

［5］Bruchez JM．Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels．Science，1998，281（5385）：2013－2016

［6］Jaiswal JK，Goldmen ER，Mattoussi H，et al．Use of quantum dots for live cell imaging．Nat Methods，2004，1（1）：73－78

［7］Valizadeh A，Mikaeili H，Zarghami N，et al．Quantum dots：synthesis，bioapplications，and toxicity．Nanoscales Res Lett，2012 ，7（1）：480－494

［8］吕蔡，张杰，庞代文等．量子点荧光技术标记肿瘤细胞中HSP的应用研究．中国组织化学与细胞化学杂志，2006，15（5）：513－516

［9］Mark H ，Hao LW ，Sujiet P，et al．Monovalent，reduced－size quantum dots for imaging receptors on living cells．Nat Methods，2008，5（5）：397－399

［10］曾庆辉，张友林，杜创等．CdTe／CdS核壳量子点与蛋白质荧光标记．高等学校化学学报，2009，30（6）：1158－1161

［11］Tracy RD，Ezequiel B，JoséA．R，et al．The transferrin receptor and the targeted delivery of therapeutic agents against cancer．Biochim et Biophys Acta，2012，1820（3）：291－317