maspin在食管鳞状细胞癌中的表达及其与微血管密度的关系

宋文庆 武世伍 俞 岚 周 蕾 承泽农 陶仪声

（蚌埠医学院第一附属医院病理科；蚌埠医学院病理学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，安徽233030）

全球每年新增食管癌病人48万余例，在所有男性恶性肿瘤中占第六位［1］，东亚是食管癌高发地区（尤其是中国、韩国和日本），其中90%以上的食管癌是鳞状细胞癌［2－3］。抑癌基因的缺失可能参与了食管癌的发生、发展，而肿瘤诱导的血管生成可能进一步促进肿瘤的侵袭、进展及转移。抑癌基因maspin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，是通过消减杂交技术对正常乳腺组织与乳腺癌组织比较时发现的。近年来的研究表明，maspin具有调节肿瘤细胞生长和侵袭的能力，包括血管生成、细胞黏附和运动等［4－8］。微血管密度（microvessel density，MVD）是反映肿瘤血管生成情况的一个很好的指标，与肿瘤的转移及预后密切相关。本研究通过检测100例食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者中 maspin与CD34蛋白的表达，分析maspin与MVD之间的关系，并探讨它们与食管鳞状细胞癌浸润、转移及预后的关系。

材料和方法

1．一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院病理科2005年1月至2006年6月存档石蜡包埋ESCC组织标本100例（术前未行放、化疗）和正常食管组织30例，所有病例均有完整的临床病理资料及随访资料，入选病例随访至患者死亡或截止2012年4月，随访时间为7－84个月（中位时间41．9±28．0）。其中男性77例，女性23例；年龄22－79岁，中位年龄60．7±9．7岁；从肿瘤位置来看，上段6例，中段73例，下段21例；肿瘤长径≥3．0cm有55例，＜3．0cm有45例；根据肿瘤分化程度，高分化26例，中分化52例，低分化22例；根据肿瘤浸润深度，黏膜下层13例，肌层41例，外膜33例，穿透外膜13例；按淋巴结有无转移，有转移41例，无转移59例；根据AJCC2010版pTNM分期标准进行分期，I期10例，II期45例，III期43例，IV期2例。30例正常食管组织作为对照。

2．试剂

鼠抗人maspin（克隆号EAW24）和CD34单克隆（克隆号 QBEnd／101），抗体购自 LabVision公司，ElivisonTM plus试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

3．免疫组织化学

将石蜡包埋组织以4μm厚连续切片，烤干，于二甲苯溶液及梯度浓度的乙醇中脱蜡至水洗。免疫组织化学染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。然后依次苏木素淡染细胞核、盐酸酒精分化、返蓝、脱水透明，最后中性树胶封片。

4．免疫组织化学结果判定

maspin以细胞核或浆出现黄色或棕黄色颗粒为阳性；CD34以细胞浆或膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。MVD通过CD34阳性的小血管来计数，参考修正的Weidner［9］。免疫组织化学结果采取二次计分法：每例标本随机计数10个高倍视野（×400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比并计分。具体方法见参考文献［10］，若积分＜3分为阴性，≥3分为阳性。免疫组织化学结果由两位病理医生采用独立双盲法判定。

5．统计分析

采用SPSS20．0统计软件进行数据分析。maspin表达与MVD（因 MVD计数的中位值为20．4±8．0，故以MVD＜20为阴性，MVD≥20为阳性）阳性组与阴性组生存分析用Kaplan－Meier法，组间比较采用log－rank检验；多因素分析采用Cox回归多因素模型分析；在ESCC组织中，maspin的表达以及MVD计数与正常食管组织、各临床及病理因素的相关性采用χ2、Spearman等级相关以及t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．maspin在ESCC及对照组中的表达

在ESCC组织中maspin主要定位于细胞核，胞浆中也偶有表达；在对照组中，maspin主要表达于基底细胞中［11］。maspin在对照组中均有表达（30／30），而ESCC中，maspin的阳性表达率为43．0%（43／100），maspin在二组之间的表达有显著性差异（P＜0．05，图1A，1B）。

2．maspin与临床病理因素的关系

maspin的表达与患者性别、肿瘤大小及位置无相关性（P＞0．05）。随着ESCC的分化越差，maspin的表达率越低，差异有统计学意义（P＜0．01）；随着ESCC癌细胞浸润越来越深，maspin的表达率越来越低，差异有统计学意义（P＜0．01）；maspin的表达率与淋巴结转移有关，淋巴结转移组中maspin表达率明显低于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0．001）maspin的阳性表达与生存期长短有关，在有淋巴结转移组与无淋巴结转移组中，maspin阳性表达组生存期均要长于其阴性表达组（图2A，2B），差异有统计学意义（P＜0．001）；maspin的表达与肿瘤分期有关，I－II期肿瘤组织中maspin的阳性率为65．5%（36／55），III－IV 期肿瘤组织中 maspin的阳性率为15．6%（7／45），两者之间差异有统计学意义（P＜0．05，见表1）。

3．MVD与临床病理因素的关系（图1C，1D）

在maspin阳性表达组，MVD的均值为16．8±6．8），在maspin阴性表达组，MVD的均值为23．2±7．8，即maspin阳性表达组中的MVD计数显著高于maspin阴性表达组（表1）。MVD计数与肿瘤大小、分化、浸润深度、临床分期及淋巴结转移均呈正相关（P＜0．05，见表1），同时，在无淋巴结转移组中，MVD＞22组的病人生存期明显短于MVD＜22组的病人，差异有统计学意义（P＜0．001），但是在有淋巴结转移组中，MVD＞22组的病人生存期与MVD＜22组的病人相比没有差异性（P＞0．05）（图3A，3B）

表1 ESCC中maspin表达和MVD计数与临床病理因素的关系Table 1 Correlation of mircovessel density to maspin expression in Esophageal Cancer

4．预后及多因素分析

maspin阳性表达组的生存率显著高于阴性表达组（P＜0．001，图4A）；MVD≥22组的生存率显著低于 MVD＜22组的生存率（P＜0．001，图4B）。多因素分析显示淋巴结转移、pTNM分期、maspin的阳性及MVD计数均是影响ESCC患者的独立预后因素（P＜0．05，表2）。

表2 100例ESCC患者多因素分析Table 2 Multivariate survival analysis of 100patients with esophageal cancer

讨 论

maspin是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，位于染色体18q21．1－q23，编码一个42kDa的蛋白，在正常乳腺中可以检测到 maspin的表达［12］。maspin可以调节肿瘤细胞的生长、侵袭及转移。为了研究maspin在ESCC发生、发展过程中的作用，我们通过免疫组织化学检测maspin蛋白在对照组食管组织及ESCC中的表达情况。在对照组中，maspin蛋白的阳性表达率为100%，而在ESCC组中，maspin蛋白的阳性表达率为43．0%。从对照组到ESCC组中，maspin的表达是降低的。进一步研究表明，maspin蛋白的表达水平与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期等密切相关。即maspin的表达越低，肿瘤的分化越差、浸润越深、临床分期越高及易发生淋巴结转移，提示maspin的表达降低或缺失可能会影响ESCC的发生发展、侵袭及转移，可能在食管上皮细胞的恶性转化过程中起重要的作用，是早期的分子事件［13］。

众所周知，在肿瘤的生长和转移过程中，肿瘤需要足够的血供及营养。当肿瘤发展到直径大于1mm3时，就会诱导血管形成以获取足够的血供。肿瘤血管形成可以通过原有血管内皮细胞的芽生，也可以通过诱导血管内皮前体细胞分化成内皮细胞而后形成血管。监测血管生成活性的重要指标－MVD，CD34标记的MVD能更好的反映肿瘤的血管生成活性［14－15］。本研究发现，在发生淋巴结转移的病例组中，其MVD计数明显高于未发生淋巴结转移的病例组，因此MVD与淋巴结转移有关；MVD与肿瘤的大小、分化程度、浸润深度及临床分期等都有关，而与患者的性别、年龄及肿瘤的位置等无关。

本研究表明，在ESCC中，maspin蛋白的表达与MVD计数具有显著的负相关性。maspin是丝氨酸激酶及MMPs抑制剂，而它们都与肿瘤进展有关；maspin可以通过减少肿瘤相关的MVD数量而抑制肿瘤的生长［16］。随着肿瘤的进展，maspin基因表达缺失或降低，丧失了对MMPs和MVD的抑制作用；且MMPs可以降解细胞外基质，从而使肿瘤细胞可以轻易地进入循环系统，造成侵袭和转移。

袭和转移是恶性肿瘤的生物学特征，术后复发和转移是造成ESCC患者治疗失败的主要原因。本研究多因素分析表明，淋巴结转移、pTNM分期、maspin的阳性表达及MVD计数是ESCC患者的独立预后因素（P＜0．05）。尽管pTNM分期作为肿瘤的治疗标准已为人们所接受，但是寻找一些能对pTNM分期起到一定补充作用的分子标记物并可以反映肿瘤的生物学行为的分子标记物也很重要。

生存分析表明，maspin蛋白表达阳性组的生存率明显高于其阴性组，而且，无论淋巴结有无转移，maspin阳性表达组的生存期也都明显高于阴性表达组，即maspin阳性表达的肿瘤患者生存率较高［17］，生存期较长；MVD≥22组的生存率明显低于MVD＜22组，MVD计数高的肿瘤患者生存率低［14，18］，在没有发生淋巴结转移的病例组中，MVD≥＞22组的病人生存期也明显短于MVD＜22组的病人，但是在淋巴结转移组中MVD≥22组的病人生存期与MVD＜22组的病人相比没有差异性，考虑可能由于样本量较小，不能完全反映MVD计数的高低与病人生存期长短的关系，有待于进一步的研究。

综上所述，通过在ESCC组织中检测MVD计数及maspin的表达，发现MVD计数高以及maspin表达缺失或降低的ESCC肿瘤细胞可能更容易侵袭、发展以及转移。因此，MVD计数和maspin可作为评估ESCC患者转移和预后的指标。

图 版 说 明

图1 maspin在食管鳞状细胞癌与正常食管黏膜中的表达A，B 在对照组和ESCC中maspin的表达，主要定位于细胞核（A对照组B食管鳞状细胞癌，ElivisionTMplus×400）；C，D MVD与临床病理因素的关系（ElivisionTMplus×400）

图2 A无淋巴结转移组中maspin阳性组与阴性组ESCC患者生存曲线（log－rank检验，P＜0．001）；B有淋巴结转移组中maspin阳性组与阴性组ESCC患者生存曲线（log－rank检验，P＜0．001）

图3 A无淋巴结转移组中，MVD≥22组与MVD＜22组的患者生存曲线（log－rank 检验，P＜0．001）；B有淋巴结转移组中，MVD≥22组与 MVD＜22组的患者生存曲线（log－rank检验，P＞0．05）

图4 maspin和MVD阳性组与阴性组ESCC患者生存曲线（log－rank检验），A maspin表达阳性组与阴性组ESCC患者生存曲线（P＜0．001）；B MVD≥22组与MVD＜22组ESCC患者生存曲线（P＜0．001）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1maspin in normal esophageal tissue and esophageal squamous cell carcinoma A，B：Expression of maspin in cell nucleus（A ．the control group B．esophageal squamous cell carcinoma，ElivisionTMplus ×400）；C，D：MVD relation with clinical pathological factors

Fig．2A：Survival curves of ESCC patients in maspin positive group and negative group without lymph node metastasis group（log－rank test，P＜0．001 ）；B：Survival curves of ESCC patients in maspin positive group and negative group with lymph node metastasis group（log－rank test，P＜0．001）

Fig．3A：Group without lymph node metastasis，MVD≥22 groups and MVD＜22groups of patients survival curves（log－rank test，P＜0．001）；B Group withlymph node metastasis，MVD≥22groups and MVD＜22groups of patients survival curves（log－rank test，P＞0．05）

Fig．4Maspin and MVD positive group and negative group ESCC patients survival curves（log－rank test）A：The expression of Maspin positive group and negative group ESCC patients survival curve（P＜0．001）；B：MVD≥22 group and MVD＜22group ESCC patients survival curve（P＜0．001）

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