骨肉瘤中血管生成拟态与HIF－1α蛋白的关系及临床意义

鲍正齐 柴大敏 肖玉周 张长春 吴 敏 周建生＊

（1蚌埠医学院第一附属医院骨科；2蚌埠医学院第一附属医院病理科，安徽233003）

骨肉瘤（osteosarcoma）是骨组织最常见的恶性肿瘤，易早期发生血行转移，在临床诊断的病例中，约80%的病例在确诊时已存在由血道转移至远处部的微小瘤灶［1］。最近的研究发现一些高度恶性肿瘤除了血管生成（angiogenesis）外，还存在一种不依赖于血管内皮细胞的血液供应模式—血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM），即肿瘤细胞通过自身变形和基质重塑产生血管样通道，从而满足自身血液供应的方式，使肿瘤更易侵袭和转移。

缺氧诱导因子－1α（HIF－1α）基因位于14号染色体，编码826个氨基酸，当细胞缺氧时，HIF－lα在细胞核内高表达。当恶性肿瘤快速生长，发生缺氧时，HIF－lα会上调VEGF等多种靶基因表达以逃避或适应相对缺氧环境，参与肿瘤生长、浸润和转移［2－3］。本研究采用免疫组织化学和组织化学染色的方法检测108例骨肉瘤和对照组28例骨软骨瘤组织中VM、HIF－1α和微血管密度（microvessel density，MVD）表达情况，分析其与临床病理因素及预后的关系，旨在探寻影响骨肉瘤侵袭、转移和生存时间的指标。

材料和方法

1．一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2003年1月至2008年12月存档石蜡包埋骨肉瘤标本108例。所有患者术前均未进行放、化疗及免疫治疗，具有完整的临床、病理及随访资料且经过患者及人体试验伦理道德委员会（蚌埠医学院）同意。病程1－4个月，平均2．42±0．45个月，男性67例，女性41例；年龄6－75岁，平均22．23±13．09岁，其中＜22岁55例，≥22岁53例；软组织浸润52例、无浸润56例；远处（包括远处）转移59例、无转移49例；肿瘤部位：膝关节附近58例（股骨下端31例、胫骨上端27例），颌骨31例（上颌骨21例、下颌骨10例），其他部位19例（肱骨上端9例，腓骨3例，锁骨3例，胸骨4例）；组织分型：骨母细胞型55例，纤维母细胞型35例，软骨母细胞型18例；病理分级低危险度（G1级）23例，中、高危险度（G2级）85例；按Enneking分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期40例，Ⅲ期45例，以同时期28例骨软骨瘤作为对照。所有标本均经过两位以上资深病理医师确诊。

2．实验试剂和方法

2．1实验试剂

鼠抗人单克隆 HIF－lα抗体（SC－53546）购自美国Santa Cruz公司，稀释浓度为 1：200；CD34（MAB－0034）单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司；ElivisionTMplus试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

2．2免疫组织化学染色

采用免疫组织化学ElivisionTMplus法，每张切片连续切数张，每张约4－5μm厚，烤干，置于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗。免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行，以PBS缓冲液代替一抗作空白对照。

2．3CD34和PAS套染及MVD计数

免疫组织化学CD34染色，DAB显色后蒸馏水冲洗1min左右终止显色反应，置于0．5%过碘酸中还原5－8min，蒸馏水冲洗2min，置于Schiff液中染色10min，0．5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，蒸馏水冲洗2min，此后依次苏木素复染细胞核、盐酸酒精分化、返蓝、脱水后中性树胶封片。CD34主要表达于血管内皮细胞的细胞质／胞膜，因而可以通过CD34的阳性表达进行MVD的计数，参照修改过的Weidner［4］法计数。

3．结果判定

HIF－lα蛋白主要位于肿瘤细胞及对照组织细胞的胞核，呈棕褐色细颗粒状，胞浆仅有少量表达。免疫组化结果采用半定量双评分法评价：每张切片随机观察10个高倍视野，每个视野计数200个细胞。阳性细胞记为：＜10%为0分；10－50为1分；51－75为2分；﹥75为3分；细胞着色强度记为：不着色为0分；浅黄色为1分；黄色为2分；棕褐色为3分。两者分数相乘0－1分为（－）；2－3分为（＋）；4－6分为（＋＋）；＞6分为（＋＋＋）。根据免疫组化结果和患者术后存活时间的不同，截定点为3，即≤3分为低表达，≥4分为过表达；免疫组化结果由资深病理医师读片评定。

4．随访

随访定义为自首发症状至死亡之间的时间为总体存活时间（Overall survival time，OS），自手术之日起至肿瘤复发或再次转移所经历时间称为无瘤存活时间（Disease free survival time，DFS），所选病例随访至患者死亡或截止2012年12月，随访时间为3－110个月。

5．统计与分析

采用SPSS19．0统计软件进行数据分析。采用Kaplan－Meier法比较 VM、HIF－lα过表达及 MVD阳性组与阴性组之间的生存差异；Log－rank检验比较组间差异；Cox多因素分析骨肉瘤患者临床病理因素及VM、HIF－lα和 MVD与预后之间的关系；VM、HIF－lα和 MVD在骨肉瘤组织及骨软骨瘤中的表达及与临床病理因素的相关性采用χ2检验及Spearman等级相关检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．骨肉瘤组织中VM与临床病理因素之间的关系

通过苏木素－伊红（HE）染色观察到在异型的细胞间有脚手架结构样骨样组织（图1A）结合影像学和临床病史确诊为骨肉瘤，且在骨肉瘤组织中存在VM结构（图1B），即肿瘤细胞围绕成管腔样结构，管腔内可有可无红细胞，具有VM的肿瘤细胞附近不见坏死的肿瘤细胞及炎症细胞；通过CD34和PAS套染VM显示为管壁没有CD34阳性的梭形内皮细胞环绕而有PAS阳性的基底膜样结构。管壁有CD34阳性的内皮细胞，无论管腔内有无红细胞，均判定为内皮依赖性血管（图1C，D）。

在108例骨肉瘤组织中查见68例存在VM样通道，其阳性率为62．96%（68／108）；骨软骨瘤中不存在VM样通道，差异具有统计学意义（P＜0．05）。VM与患者的性别、年龄、部位、组织学分型及直径之间差异无统计学意义（P＞0．05），与病理分级、软组织浸润、远处转移及临床分期组间差异均有统计学意义（P＜0．01），见表1。

2．骨肉瘤组织中HIF－lα过表达及其与临床病理因素之间的关系

HIF－lα主要表达于细胞核，呈棕褐色（图1E，F）。HIF－lα在骨肉瘤及骨软骨瘤组织中过表达率分别57．41%（62／108）和32．14%（9／28），组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）；HIF－lα表达水平与患者的性别、年龄、部位、组织学分型及直径之间差异无统计学意义（P＞0．05）；与病理分级、软组织浸润、远处转移及临床分期间差异有统计学意义（P＜0．01），见表1。

3．骨肉瘤组织中 MVD与临床病理因素、VM及HIF－lα蛋白过表达之间的关系

MVD的均值为22．47±8．38，故以 MVD＜22为阴性组，MVD≥22为阳性组。MVD在骨肉瘤组织中阳性率为58．33%（63／108），在骨软骨瘤组织中阳性率为28．57%（8／28），组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）。MVD与患者的性别、年龄、部位、组织学分型及直径之间差异无统计学意义（P＞0．05）；与病理分级、软组织浸润、远处转移及临床分期间差异有统计学意义（P＜0．01），见表1。

Spearman相关分析显示，在骨肉瘤组织中VM，HIF－lα蛋白过表达及 MVD两两之间均呈正相关（P＜0．01，表2）。

表1 骨肉瘤患者中VM、HIF－1α过表达及MVD与临床病理因素之间的关系（n＝108）Table 1 Correlation of VM，over－expression of HIF－1αand MVD to clinicopathologic characateristics in osteosarcoma（n＝108）．

表2 骨肉瘤组织中VM、HIF－lα表达水平及MVD之间的相互关系（n＝108）Table 2 The association of VM，HIF－lαand MVD in osteosarcoma（n＝108）

4．多因素预后分析

将性别（男与女）、年龄（＜22岁与≥22岁）、肿瘤部位（膝关节附近、颌骨与其他部位）、病理分级（G1组与G2组）、组织类型（骨母细胞型、纤维母细胞型与软骨母细胞型）、肿瘤直径（≥5．0cm组与＜5．0cm组）、软组织浸润（浸润组与无浸润组）、远处转移（转移组与无转移组）、Enneking分期（Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ期）、VM（阴性组与阳性组）、MVD（≥22组与＜22组）和HIF－lα蛋白（过表达组与低表达组）等因素引入Cox模型进行多因素预后分析，结果显示VM、HIF－lα蛋白表达的水平和MVD、软组织浸润、远处转移及Enneking分期是影响骨肉瘤患者预后的独立因素（P＜0．05，表3）。

5．生存分析

Kaplan－Meier生存分析显示108例骨肉瘤患者，至随访结束之日起，存活时间超过60个月（5年）者共41例，即总体5年存活率为37．97%（41／108）。VM阳性与阴性组、HIF－1α过表达与低表达组及MVD≥22与＜22组间比较差异有统计学意义（P＜0．05），见表4，生存曲线见图2。

表3 108例骨肉瘤患者COX多因素生存分析Table 3 Multivariate survival analysis of 108patients with osteosarcoma

表4 不同VM、HIF－1α和MVD组骨肉瘤患者5年存活率、总体和无瘤存活时间Table 4 The 5－year－survival rate，overall and disease free survival time of patients with osteosarcoma in different VM，HIF－1αand MVD groups

讨 论

血管生成拟态是1999年由 Maniotis［5］等首次提出，即后来被Folberg等［6］描述的PAS阳性图案：直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的（没有完全封闭）、有分支的彩虹样的、封闭的环状的和网络状的通道（即最少有3个背靠背的PAS阳性环）。该通道的特点是无内皮细胞衬覆，内皮细胞特异标记物（CD31，CD34，FⅧ）染色均为阴性，肿瘤细胞模仿机体血管形成而形成瘤细胞条索并围成通道，而血液可在这无内皮细胞的通道中流动，通道外周是一层厚薄不一的PAS阳性物质构成的基底膜。研究发现在恶性黑色素瘤、炎性乳腺癌、肝细胞性肝癌、胃恶性间质瘤、非小细胞肺癌［7－10］等高度侵袭性肿瘤中存在VM。本研究108例骨肉瘤组织中68例存在符合VM结构的管道，而正常骨软骨瘤组织中不存在VM结构，组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）。存在VM的骨肉瘤患者病理分级较差、软组织浸润及远处转移率较高且Enneking分期更晚（Ⅱ和Ⅲ期），组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。VM阳性组患者的5年存活率（8．82%）显著低于VM阴性组患者（87．5%），且患者总体生存时间（28．5±1．39）及无瘤生存时间（12．250±0．736）均显著低于VM 阴性组（68．5±1．15和38．725±2．207）。我们观察到在VM区域肿瘤细胞坏死现象不明显，说明在VM存在的情况下确实形成了有效的血液供应模式。正如Zhang et al［11］提出的肿瘤血供的“三阶段现象”，即在肿瘤小于2．0mm时，主要是通过VM形成的功能性微循环供血；之后内皮细胞长入肿瘤细胞之间形成马赛克血管，管腔由肿瘤细胞和内皮细胞共同构成；然后进一步成熟为内皮依赖性微血管。我们的研究中，根据 Weidner［2］计数法 MVD≥22组患者远处转移及软组织浸润率显著高于MVD＜22组患者；MVD≥22组患者具有更晚的Enneking分期（Ⅱ和Ⅲ期）和更高的病理分级（G2）。MVD≥22组患者5年存活率（3．17%）明显低于MVD＜22组5年存活率（86．67%）；且MVD≥22组患者平均OS和平均DFS（分别为27．33±1．21和11．762±0．757）显著低于MVD＜22组患者（65．69±1．87和36．467±2．186）。

本研究结果显示，在108例骨肉瘤患者中有62例HIF－1α过表达，其过表达率57．41%高于骨软骨瘤32．14%（P＜0．05）。HIF－1α过表达组骨肉瘤患者较HIF－1α低表达组患者具有更差的病理分级、更晚的临床分期且更易发生远处转移和软组织浸润；HIF－1α过表达组患者5年存活率（8．06%）显著低于 HIF－1α低表达组（78．26%）；HIF－1α过表达组患者平均 OS（27．16±1．31）和平均 DFS（11．903±0．766）也显著低于 HIF－1α蛋白低表达组平均OS（65．09±1．80）和平均 DFS（35．739±2．252）。Spearman相关性分析显示HIF－lα过表达与 MVD及VM之间呈正相关性（P＜0．01），提示在肿瘤快速生长发生缺氧时，引起 HIF－1α的积聚和活性增高，调节其下游基因的转录和表达，刺激肿瘤微血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、促进其转移，使肿瘤细胞适应缺氧微环境并且不断增殖、侵袭和转移［12－13］。有研究显示HIF－lα通过上调或下调肝素酶和曲古抑菌素使骨肉瘤细胞和组织中 MVD 增大［14－15］，我们推测HIF－lα过表达在参与肿瘤MVD形成同时，某些具有可塑性的肿瘤细胞就会变形，形成VM通道使肿瘤细胞获得足够氧供，这也可以解释为什么具有VM结构的肿瘤细胞周围坏死较少。我们的结果和国内外很多文献报道抑制HIF－1α的表达可以阻断 VM 的形成一致［16－18］，这些提示我们，缺氧很可能是诱导肿瘤细胞形成VM的一个重要始动因素。多因素分析显示MVD、VM及HIF－1α蛋白过表达、远处转移、软组织浸润和Enneking分期是影响患者的独立危险因素。

综上所述，HIF－1α过表达可能是骨肉瘤发生侵袭、转移的分子生物学基础，血管新生和VM可能是骨肉瘤发生侵袭、转移的关键过程。而HIF－1α、VM和MVD可能成为患者预后判断的病理学指标，为骨肉瘤患者的治疗提供新的靶点。

图 版 说 明

图1 VM及HIF－lα蛋白在骨肉瘤及骨软骨瘤组织阳性染色（×400）A骨肉瘤组织中骨样组织及异型细胞（HE×400）；B骨肉瘤组织中VM结构（箭头所示，HE×400）；C，D骨肉组织中VM及微血管（黑箭头示VM，红箭头示微血管，CD34＋PAS×400）；E骨肉瘤组织中 HIF－lα过表达（ElivisionTM×400）；F 骨软骨瘤组织中 HIF－lα弱表达（ElivisionTM×400）。

图2 108位骨肉瘤患者VM阴性及阳性、HIF－1α蛋白过表达及低表达和MVD≥22和＜22总体及无瘤生存曲线。A VM阳性及阴性组患者总体生存曲线；B VM阳性及阴性组患者无瘤生存曲线；C HIF－1α蛋白过表达阳性及阴性组患者总体生存曲线；D HIF－1α蛋白过表达阳性及阴性组患者无瘤生存曲线；E MVD≥22和＜22组患者总体生存曲线；F MVD≥22和＜22组患者无瘤生存曲线。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Positive staining of VM and HIF－lαprotein in osteosarcoma and osteochondroma （×400）A There were osteoid tissue and atypia tumor cells in osteosarcoma（HE×400）；B There were VM in osteosarcoma（black arrow，HE ×400）；C，D Positive staining of VM and micro－vessel（black arrow is VM，red arrow is micro－vessel，CD34＋PAS double staining×400）；E Over－expression of HIF－lαin osteosarcoma （ElivisionTM ×400）；F Low－expression of HIF－lαin osteochondroma（ElivisionTM×400）．

Fig．2The overall and disease－free survival curve of 108patients in VM positive or negative groups，over－or low－expression of HIF－1αprotein groups and MVD≥22or＜22groups with osteosarcoma．A Overall survival curve of osteosarcoma patients with VM positive or negative group；B Disease－free survival curve of osteosarcoma patients with VM positive or negative group；C Overall survival curve of osteosarcoma patients with HIF－1αprotein over－or low－expression groups；D Disease－free survival curve of osteosarcoma patients with HIF－1αprotein over－or low－expression group；E Overall survival curve of osteosarcoma patients with MVD ≥22or＜22groups；F Disease－free survival curve of osteosarcoma patients with MVD ≥22or＜22groups．

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