5-脂氧合酶与动脉粥样硬化关系研究进展

刘春丽综述 蔡 辉审校

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的重要病理生理基础,近年来,大量人体和动物实验研究表明,5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase,5-LO)在 AS形成中发挥重要作用。本文就5-LO与AS形成的有关内容作一综述。

1 5-LO的生物学特性

1.1 5-LO途径

5-LO是三种脂氧合酶(5-LO、12-LO、15-LO)同工酶的一种,分子量约为72 000～80 000D,是机体催化花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA)生成生物活性分子—白三烯(Leukotrienes,LTs)的关键酶。人5-LO基因位于10号染色体上,长度为82kb,主要包括14个外显子(Exons),13个内含子(Introns)。5-LO蛋白主要由调节区和催化区两个区域组成,二者均具有典型C2结构域,其中含有的β折叠结构主要与钙离子、核苷酸、磷脂类结合[1],酶的催化活性主要受调节区控制。

在动物体内,5-LO催化 AA,产生5-羟-6,8,11,14-二十四碳四烯酸,生成环氧化物白三烯 A4(LTA4),LTA4在LTA4水解酶和 LTC4合成酶作用下分别生成 LTC4、LTD4,LTD4在脱肽酶作用下进一步转化成LTE4,后三者结构中均含有半胱氨酸,故又合称为半胱氨酸白三烯(Cysteinyl-Leukotrienes,CysLTs),这条合成LTs的途径称之为5-LO途径(5-Lipoxygenase Pathway)。研究发现,5-LO途径生成的LTs与细胞膜特殊G蛋白耦联LTs受体结合,其中LTB4主要与 LTB受体(包括LTBR1和LTBR2),Cys-LTs主要与 CysLT受体(包括CysLTR1和 CysLTR2)通过促进炎性细胞黏附、脱颗粒(Degranulation)反应,增加血管通透性(Vascular Permeability)等作用,参与血管炎症、动脉内膜损伤过程。此外,近年研究发现,5-LO途径还具有转导、调节细胞核内信号的作用。Orasanu等[2]发现5-LO途径产物LTB4与细胞核受体结合后,激活过氧化物酶体增生物激活受体-α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor,PPAR-α),并诱导 PPA R-α敏感基因转录,加剧内皮细胞炎症反应。

5-LO作为白三烯合成限速酶,主要定位于血清和/或细胞核中,免疫组化分析显示5-LO主要表达于小鼠动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞、平滑肌细胞中。动脉内皮细胞虽不表达5-LO,但跨膜细胞代谢产生的LTA 4与内皮细胞表达的LTA 4水解酶、LTC4合成酶结合后,生成 LTB4和CysLTs,进而对内皮细胞产生作用。

1.2 5-LO活性调节因素

5-LO活性水平受多种因素调节。研究发现,细胞内钙蛋白水平是5-LO激活的决定因素。研究发现,巨噬细胞和白细胞迁移至炎症位点后,钙离子释放活化钙通道(Calcium-Activated Release Channel,CA RC)开放后,细胞内钙离子水平升高,钙离子通过与5-LO的N末端C2样结构域结合后,增加5-LO疏水性,促其转移至细胞膜,进而与膜上5-LO激活蛋白(5-Lipoxygenase Activating Protein,FLAP)结合而发挥作用。当细胞内钙离子浓度在4～10μmol/L时,5-LO达到最高活性水平。体内激酶水平对细胞5-LO活性也起重要调节作用。研究发现,丝裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2(Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated Protein 2,MAPKAP-K2)和细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK)通过磷酸化5-LO后,均可导致其活性水平升高[3]及与细胞膜结合作用增强。当给予MAPKAP-K2和ERK抑制剂后,5-LO活性和膜结合能力均受到抑制。5-LO核心启动子去甲基化(Demethylation)是5-LO完全表达的先决条件,当用一种去甲基化抗原处理培养中的巨噬细胞,即能明显上调这些细胞5-LO m RNA表达水平。此外,Fair等[4]研究发现,利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理U937和HL60髓细胞后,能够显著增加5-LO转录活性和FLAP的表达。

2 5-LO与AS

大量人体和动物实验研究表明,5-LO在正常血管内膜中表达很少或几乎不表达,而在AS损伤动脉中大量存在,主要集中于巨噬细胞、树突状细胞、泡沫细胞、肥大细胞、中性粒细胞等,且与AS内膜损伤程度呈正比。Mehrabian等[5]研究发现,5-LO大量表达于载脂蛋白E和低密度脂蛋白受体基因敲除(ApoE-/-/LDLR-/-)小鼠AS斑块中,当将 5-LO+/-小鼠骨髓移入LDLR-/-高胆固醇血症小鼠体内后,子代LDLR-/-/5-LO-/-小鼠体内AS动脉损伤明显减少,5-LO mRNA表达水平较对照组小鼠降低5倍。此外,5-LO途径下游产物LTB4能够减少脂肪细胞对游离脂肪酸的摄取,造成血清游离脂肪酸水平升高;而5-LO抑制剂能够降低脂肪组织脂解(Lipolysis)和改善体内脂质代谢。在对ApoE-/-高脂血症小鼠肝细胞的变性研究时发现,在5-LO基因敲除小鼠体内,PPAR-γ、胰岛素受体底物-1(Insulin Receptor Substrate-1)以及脂联素(Adiponectin)表达水平均上调,导致机体脂肪组织对胰岛素敏感性显著增强[6]。亦即5-LO的作用从多个方面影响AS形成。

2.1 5-LO基因多态性与心血管病变

人的5-LO基因起始密码子ATG上游145～179bp有一富含GC区,可以与转录因子Sp1结合,核心启动子GC区包含5个 Sp1/Egr1结合序列串。Geiger等[7]通过对187名健康无亲缘关系的高加索人群5-LO基因结构分析后发现,Sp1/Egr1启动子串联重复序列突变率最高的等位基因频率为84%。启动子GC框变异能够显著增加血管内-中膜厚度,提高血清C-反应蛋白水平,并与LTs水平一致,表明该变异可能通过上调5-LO蛋白表达而发挥作用[8]。Dwyer等[9]对470名来自洛杉矶AS协会成员5-LO启动子基因研究后发现,6%成员发生变异,与正常野生基因组相比,携带两种变异等位基因者颈动脉内-中膜厚度增加80±19μm,但给予n-3游离脂肪酸饮食以竞争性抑制5-LO底物后,能够减少AS发生,表明5-LO启动子基因变异与AS形成有关。Allayee等[10]也发现5-LO启动子等位基因变异导致5-LO表达增加,增加AS和心肌梗死发生风险。但Maznyczka等[11]通过对北美高加索人群5-LO基因进行研究后发现,5-LO基因多态性并不是该人群心肌梗死的主要危险因素。

2.2 5-LO与炎症

炎症是AS形成的重要因素,大量炎性细胞聚集、激活,释放大量细胞因子,造成内膜炎症反应,最终损伤血管结构。

研究发现,在人 AS内膜中,炎症激活的巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞均大量表达5-LO,在单核细胞转化为组织巨噬细胞过程中,5-LO表达水平明显上调,然而在非炎症期,5-LO活性水平无明显变化。Horrillo等[12]发现,在肥胖小鼠脂肪细胞中,5-LO在FLAP辅助作用下,激活脂肪细胞核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB),促进单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、白介素(Interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)释放增加,加剧脂肪组织炎症反应。单核细胞聚集、黏附于血管内皮细胞,最终激活、衍化成泡沫细胞是AS形成的早期事件和始动环节。MCP-1是激活单核细胞聚集、黏附过程最重要的细胞因子。在单核细胞中,5-LO能够通过细胞表面LTB1R和LTB2R作用,快速诱导MAPKs,ERK1/2和Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal Kinase,JNK)1/2、磷脂酰肌醇-3-激酶/丙氨酸氨基转移酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/Alanine Aminotransferase,PI3K/Akt)磷酸化,并在MAPK-ROS(Reactive Oxygen Species)依赖机制下增加NF-κBDNA结合活性,参与炎症过程。在ApoE-/-/5-LO-/-小鼠损伤动脉内膜中,MCP-1合成明显减少。5-LO途径合成的 LTB4通过 LTBR1介导,通过激活ERK 1/2或JNK/MAPK通路,增加MCP-1转录活性,并呈时间和剂量依赖性,但这种作用能被LTBR1受体拮抗剂-CP105、696阻断[13]。另外,LTB4还能增加IL-6、TNF-α表达,促进血管炎症发生[14]。研究发现,5-LO参与激活的炎症反应参与多种疾病的发生,而且这种炎症对激素治疗无效,但给予LTB1或CysLT1受体拮抗剂后,可明显抑制这种炎症反应[15]。

2.3 5-LO与血管内膜增生及斑块形成

研究发现,5-LO途径与AS内膜增生及斑块形成密切相关。细胞因子IL-1β能够促进内膜增厚、平滑肌细胞增殖,5-LO能够诱导单核细胞分泌IL-1β,当抑制5-LO或FLAP作用时,IL-1β分泌减少。AS斑块造成的血管狭窄起始于血小板沉积,由激活的血小板释放大量促有丝分裂物质促进成纤维细胞增生而形成。Berg等[16]通过RT-PCR等检测发现,当成纤维细胞与血小板相互作用1h后,前者5-LO蛋白表达明显增加,成纤维细胞增生作用也明显增强,当给予5-LO抑制剂5,6-dAA(5,6-Dehydro Arachidonic Acid)处理后,成纤维细胞增殖作用明显受到抑制,表明5-LO介导血小板诱导成纤维细胞增殖过程。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor,VEGF)在 AS形成中发挥重要作用,除了促进血管生成,还有利于斑块形成,增加血管通透性,介导单核细胞黏附和趋化作用。Celletti等[17]用VEGF(2μg/kg)处理ApoE-/-/B100-/-小鼠,发现小鼠骨髓、外周血巨噬细胞水平、斑块面积在处理后的第1、2、3周较对照组小鼠分别增加 5、14和4倍。Rome等[18]发现5-LO反义寡核苷酸能够减少VEGF mRNA表达,并呈时间依赖性;当将5-LO cDNA转染5-LO-/-细胞后,VEGF生成明显增加,进一步研究发现,AA和5-羟-二十四碳四烯酸(5HETE)能够促进VEGF基因表达和蛋白释放。

免疫组化显示在不稳定性斑块以及容易破裂的斑块纤维帽肩部,均有大量的5-LO表达,表明5-LO与AS斑块稳定性有着密切联系[21]。Cipollone等[22]发现在AS患者中,有临床症状者粥样硬化斑块的5-LO表达水平较之无症状者明显升高,基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9表达水平和活性水平均增加,并与5-LO表达明显相关。Zhao等[23]研究发现,5-LO基因敲除小鼠动脉瘤形成明显减少,免疫组化示MMP-2和巨噬细胞炎症蛋白-1α(Macrophage Inflammatory Protein,MIP-1α)表达明显下降。细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)金属蛋白酶诱导剂通过激活磷脂酶A2(Phospholipase A 2,PLA 2)/5-LO途径促进MMP-2分泌,导致斑块不稳定性增加。

2.4 5-LO血管反应

肾素-血管紧张素轴是体内血管舒缩反应的主要调节轴。研究发现,5-LO途径合成的 LTs通过相应受体介导,也参与血管舒缩反应。CysLTs主要分布在AS的平滑肌细胞、内膜发生增生处和斑块形成区域,介导血管舒缩反应,并呈剂量依赖性,CysLTR1主要介导收缩信号,而CysLTR2主要介导舒张信号,至于最终的血管反应,主要看何种受体分布占优势。Ishizaka等[19]发现血管紧张素II(Angiotensin,AngII)具有调节5-LO途径成分LTA 4水解酶表达的作用,当利用微型真空泵持续输注AngII 7天后,LTA4水解酶mRNA和蛋白表达水平较之对照组上调达3.5倍。Voelkel等[20]发现FLAP抑制剂M K-886能够抑制 AngII引起的血管收缩效应,5-LO-/-小鼠左心肥大较之对照组小鼠明显减少。这些研究均表明,5-LO途径可能通过肾素-血管紧张素轴参与调节血管舒缩反应,在AS形成中发挥作用。

2.5 5-LO与细胞凋亡

长期以来,人们在肿瘤细胞的研究中发现,5-LO途径产生5HETE和5-氧-二十四碳四烯酸(5-Oxo-Eicosatetraenoic Acid)对肿瘤细胞起促分裂作用,当阻断5-LO信号途径后,能够阻断肿瘤细胞生长,并促使其发生凋亡。在AS斑块中心,组织细胞发生凋亡和坏死,导致斑块坏死中心的形成,是斑块遭受侵蚀和发生破裂的重要病理生理基础。现代研究发现,5-LO能够诱导凋亡介质表达,采用 5-LO抑制剂Zileuton或MK-886能够明显抑制巨噬细胞凋亡,但不能阻断5-LO-/-巨噬细胞的凋亡,表明5-LO可能参与巨噬细胞凋亡过程。Maccarrone等[24]研究发现5-LO介导线粒体解耦联过程有助于细胞发生凋亡,给予5-LO抑制剂能够阻断凋亡小体形成。此外,5-LO途径产物LTB4、LTD4和5HETE均能增强TNF-α诱导的细胞凋亡效应。5-LO与AS斑块中的巨噬细胞凋亡是否具有相关性,以及具体作用机制,尚待进一步研究。

3 小 结

总之,5-LO通过促进炎症反应、改变斑块稳定性、介导血管反应及细胞凋亡等过程参与AS形成,是认识并干预AS形成过程的新的路径。但对其具体机制、调节方式及阻断策略等有待进一步探索、研究,使之更有效地干预5-LO作用过程,减少AS的发生和发展。

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