不同模式低氧耐力训练对大鼠肝组织HIF-1α、HO-1 m RNA表达的影响

徐建方，冯连世，路瑛丽，张 漓，王雪冰

低氧训练的有关研究源于对高原训练的探索，其基本原理在于利用低氧和训练的双重刺激，使机体产生一系列的适应性改变，以最大限度地发挥机体的运动潜能[1]。作为介导细胞低氧反应的核转录因子，低氧诱导因子-1α （HIF-1α）受低氧诱导，在机体低氧应答和低氧训练适应性改变的过程中扮演着重要的角色。大量研究表明，涉及血管舒张、血管生成、细胞凋亡与增殖等方面的多种靶基因受 H IF-1α调控，如诱导型一氧化氮合酶（NOS）、血红素加氧酶（HO）、血管生长因子（VEGF）等[5，7，14]。HO是催化血红素生成胆绿素、铁和CO的微粒体酶，HO-1为其亚基，在改善血流、提高机体应急能力和保护能力的过程中具有重要的作用[8，13]。

众所周知，为满足训练需要，在运动训练过程中，不可避免地存在着血液重新分配问题，本研究拟就高住高练、高住低练、低住高练3种不同低氧训练模式对大鼠肝组织HIF-1α、HO-1mRNA表达的影响进行研究，探讨低氧训练时内脏器官的适应性变化。

1 材料与方法

1.1 实验对象

90只6周龄雄性SD大鼠，分笼饲养，每笼5只，室温23℃～25℃，湿度40％～60％，自然光照，自由饮食。

1.2 训练方式

90只实验大鼠经适应性训练筛选出60只，随机分为6组，每组10只：1）常氧安静组；2）低氧安静组；3）低住低练组；4）高住高练组；5）高住低练组；6）低住高练组。所有训练组采用水平动物跑台进行耐力训练（表1）。

表1 本研究动物实验安排一览表

1.3 实验取材

安静组4周末，运动组最后一次训练恢复24 h，按0.3 m l/100 g体重剂量腹腔注射10％水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，期间迅速分离出大鼠肝组织在预冷的生理盐水中漂洗去血，滤纸吸干水分，放液氮中速冻，待测。

1.4 指标测试方法

1.4.1 主要试剂及仪器

MyLab通用型 RNA快速提取试剂盒（美莱博医学科技有限公司，中国）；M-MuLV反转录酶：200u/μl，Fermentas（MBI公司，美国）；RNase Inhibitor：40u/μl，Fermentas （MBI，美国）；420×EvaGreen（Biotium，美国）；Takara TP600型梯度 PCR仪（Takara公司，日本）；SLAN双通道荧光定量PCR仪（宏石医疗科技有限公司，中国）。

1.4.2 测试方法

1.肝组织总RNA提取：用MyLab通用型RNA快速提取试剂盒提取样品 RNA，最后加入30μl无 RNase的水，溶解 RNA。用DNase I消化样品 RNA中的DNA （表2）。

表2 DNA消化方法一览表

2.RNA反转录为cDNA（表3）。

表3 反转录操作程序一览表

3.引物设计：所有引物设计均为先通过互联网从genebank查询到各个目的mRNA原序列，选择合适的序列范围，再用p rimer 5引物设计软件筛选出合适的引物，各引物序列如下：

β-actin：上游引物-GAAGTGTGACGTTGACATCCG，

下游引物GCCTAGAAGCATTTGCGGTG；

HIF-1α：上游引物CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG，

下游引物TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG；

HO-1：上游引物CAGACAGAGTTTCTTCGCCAG，

下游引物AGAGAGAAGGCTACATGAGACAG。

4.定量PCR检测：取0.2μl薄壁 PCR管，分别编号，向各管中加入不含染料2×qPCR TaqMix 12.5μl，10μM各基因正反向引物混合物0.5μl，对应的cDNA各1μl，一管中不加模板用作阴性对照，各管补加水至25ml，混匀，置于SLAN荧光定量 PCR仪中。95℃5 min预变性后， 95℃15 s→65℃35 s（荧光检测），40个循环。

1.5 数据统计

2 实验结果

2.1 低氧训练对肝组织 H IF1-αmRNA表达的影响

表4显示，低氧安静、低住低练、高住高练、高住低练和低住高练组较常氧安静组，肝组织 HIF-1αmRNA表达均有非常显著性的升高（P＜0.01），其中，高住高练和低氧安静组升高最为明显，分别达到866和802倍，高住低练、低住高练、低住低练组分别升高55、151和34倍。

与低住低练组相比，低氧安静和高住高练组肝组织HIF-1αmRNA表达有非常显著性的升高（分别为23.6和25.8倍，P＜0.01）；高住低练、低住高练组肝组织则无明显变化。

高住高练组肝组织 H IF-1αmRNA表达较高住低练和低住高练组均有非常显著升高（分别达15.7和5.7倍，P＜0.01）。

高住低练组、低住高练组肝组织 HIF-1αmRNA表达较低氧安静组均有非常显著性降低（下降达93.8％和76.3％，P＜0.01）。

2.2 低氧训练对肝组织 HO-1 mRNA表达的影响

表5显示，与常氧安静对照组相比，高住低练组肝组织HO-1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；低氧安静、低住低练、高住高练和低住高练组肝组织 HO-1 mRNA表达均有非常显著升高（分别达 551、322、875和 324倍，P＜ 0.01）。

与低住低练组相比，高住高练组肝组织 HO-1 mRNA表达显著升高（2.7倍，P＜0.05）；高住低练、低住高练组则无明显变化。

高住高练组肝组织HO-1 m RNA表达较高住低练组、低住高练组均有显著升高（分别达 2.2和2.7倍，P＜ 0.05）。

表4 低氧训练对大鼠肝组织HIF-1αm RNA表达的影响一览表

表5 低氧训练对大鼠肝组织HO-1 m RNA表达的影响一览表

3 分析与讨论

缺氧是对机体的异常刺激，机体通过特定的系统感受缺氧后，会发生一系列生理反应，如促红细胞生成素（EPO）、内皮素-1（ET-1）、VEGF等表达增多，以维持功能，减少伤害。目前，关于缺氧感受信号传递的学说有：血红素蛋白学说、NO和CO学说、NAD（P）H学说、线粒体学说和 HIF-1α感受氧学说等。低氧训练作为运动训练实践中的辅助手段，对机体产生环境低氧和运动缺氧的双重刺激，进一步诱导机体的适应性改变[15]。

3.1 低氧训练对肝组织 H IF-lαmRNA表达的影响

HIF-1作为一种转录因子，低氧时广泛分布于心、肝、肾、肺、脑、肌肉等许多组织细胞，是低氧反应基因（HRG）表达的生理性调控因子，可以被多种胞外刺激活化、上调，介导低氧反应，影响细胞存活、生长、分化以及凋亡等基因的表达。研究证实，H IF-1是调节氧稳态平衡的主要调节因子，在机体生理和病理过程中发挥重要作用。目前，发现40多个基因受其调控，涉及到血管生成、血管舒张、能量代谢、葡萄糖代谢、细胞增殖和细胞凋亡等[2，4]。

已有研究表明，H IF-1α在低氧训练的适应过程中发挥重要作用，参与VEGF、iNOS、HO-1等mRNA表达的调控。Hoppeler发现，未经训练的健康人在海拔3 850 m低氧环境下进行6周耐力训练后，其骨骼肌 H IF-1αm RNA明显上调，VEGF mRNA和肌红蛋白mRNA表达也增加；而常氧状态下则无显著变化，研究提示低氧训练导致 H IF-1α mRNA表达增加不依赖于运动训练的强度[14]，这在赵鹏等的研究中也得到了证实。他们的研究发现，高住高练、高住低练和持续低氧安静组骨骼肌 H IF-1α表达都明显增强，而低住低练和低住高练变化不大，复氧训练后回到常氧安静水平，说明 H IF-1α表达与低氧（或缺氧）的程度和时间有明显的依存关系[10]。刘文峰等研究发现，与安静对照组相比，不论是单纯低氧暴露、单纯训练，还是高住低练都能促进肝组织 HIF-1α的蛋白表达；高住低练过程中肝组织 H IF-1α蛋白表达高于单纯低氧暴露或单纯训练方式，不同持续时间低氧后运动对大鼠肝组织 HIF-1α蛋白表达的影响不同[3]。

本研究发现，低氧安静、低住低练、高住高练、高住低练和低住高练组肝组织 HIF-1αmRNA表达较常氧安静组均有非常显著性的升高（P＜0.01），其中，高住高练和低氧安静组升高最为明显分别达到866和802倍；而高住低练、低住高练、低住低练组则分别升高55、151和34倍，这提示，低氧和不同形式的运动均能影响机体肝组织 H IF-1αmRNA的表达。

与低住低练组相比，高住高练组肝组织HIF-1αmRNA表达有非常显著性的升高（达25.8倍，P＜0.01）；而高住低练、低住高练组肝组织则无明显变化。并且，高住高练组肝组织 H IF-1αm RNA表达较高住低练、低住高练组均有非常显著升高（分别达15.7和5.7倍，P＜0.01）；而高住低练组、低住高练组肝组织 HIF-1αmRNA表达较低氧安静组均有非常显著性降低（下降达93.8％和76.3％，P＜0.01）。

以上结果显示，单纯低氧、单纯训练，以及不同模式低氧训练都能明显诱导肝组织 HIF-1αmRNA的表达；持续低氧对肝组织 HIF-1αmRNA表达的影响比间歇低氧更为明显，表现为高住高练较高住低练、低住高练影响更显著，提示低氧和训练的双重刺激对肝组织 HIF-1αmRNA表达产生更深刻的影响。

3.2 低氧训练对肝组织 HO-1 mRNA表达的影响

HO是催化血红素降解的始动酶和限速酶，生成胆绿素、铁和CO。HO系统存在3种亚型蛋白，它们分别为诱导型HO-1和结构型 HO-2、HO-3。HO-1现已证明为人类热应激蛋白（HSP32），生理状态 HO-1表达是低水平的，但在各种刺激如血红素、紫外线、缺氧、重金属、细胞因子、炎症因子等以及各种应激状态后，其表达很快上调。HO-2是一种结构型基因，是生理状态下 HO的主要存在形式。HO-3与HO-2有着约90％的同源性，但缺乏催化活性，其生物学特性和功能有待于进一步研究[8，16]。

多数研究结果表明，CO在细胞功能的调节中发挥着重要作用。特别是与运动能力紧密相关的心血管系统， CO通过激活sGC来诱导血管平滑肌的舒张，抑制血管平滑肌细胞增殖等作用；促进VEGF的合成；抑制血小板的黏附和聚集，调节血压、改善主动脉血流等作用[6，9]。

另有研究表明，CO能提高机体的免疫保护能力，抑制多种因素引起的细胞凋亡，以及提高机体应激能力和自身保护能力。周君琳等报道，HO活性和CO生成量的增多可减轻大鼠肢体缺血再灌注所致的肺损伤[12]。

多数研究已经证实，H IF-1α对 HO-1的表达具有调节作用，主要通过作用于血管平滑肌细胞 HO-1基因，产生HO-1，催化产生CO。CO以气体信使的身份激活鸟苷酸环化酶，从而实现生理功能[5，16]。

赵鹏等的研究表明，持续低氧和间歇低氧均有提高骨骼肌 HO-1 mRNA表达的趋势，其中，高住高练和低住高练最有利于 HO-1表达增强；常氧安静、间歇低氧安静、低住低练和低住高练组骨骼肌 HO-1表达主要在细胞膜上，而持续低氧安静、高住高练、低住高练、低氧训练后复氧训练组 HO-1表达却主要在胞浆中[11]。

本研究发现，与常氧安静对照组相比，高住低练组肝组织HO-1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；低氧安静、低住低练、高住高练和低住高练组肝组织 HO-1 mRNA表达则均有非常显著升高（分别达551、322、875和324倍，P＜0.01）。

与低住低练组相比，高住高练组肝组织 HO-1 mRNA表达显著升高（2.7倍，P＜0.05）；高住低练、低住高练组则无明显变化；且高住高练组肝组织 HO-1 mRNA表达较高住低练组、低住高练组均有显著升高（分别达2.2和2.7倍，P＜0.05）。

上述结果显示，肝组织HO-1 mRNA的表达与 HIF-1α mRNA的表达有高度的一致性，单纯低氧、单纯训练和不同模式低氧训练均引起肝组织 HO-1 m RNA表达的升高；与低住低练相比，3种低氧训练模式中，仅高住高练明显影响肝组织HO-1 mRNA的表达，高住低练和低住高练无显著影响。

4 结论

1.单纯低氧、单纯训练和不同模式低氧训练均能显著提高肝组织H IF-1α、HO-1 m RNA的表达，有利于改善特殊情况下内脏器官的血液供应。

2.高住高练对肝组织 HIF-1α、HO-1 mRNA表达的影响较低住低练、高住低练和低住高练更为明显，提示机体为应对双重刺激，产生更为深刻的适应性反应。

[1]冯连世.高原训练与低氧训练[J].体育科学，2005，25（11）：封二.

[2]刘建红，周志宏，欧明毫，等.低氧诱导因子-1与低氧训练[J].中国运动医学杂志，2003，22（6）：600-602.

[3]刘文峰，翟树林，汤长发.高住低练对大鼠肝组织低氧诱导因子-1α蛋白表达的影响[J].中国运动医学杂志，2008，27（1）：11-14.

[4]倪永兵，王斌，肖继皋.低氧诱导因子1和血管内皮生长因子与血管新生[J].国外医学·生理、病理科学与临床分册，2002，22 （3）：266-269.

[5]孙健乐，夏振炜，张雪洪，等.保护基因HO在组织细胞中的作用及其作用机制研究进展[J].生命科学，2003，15（4）：220-223.

[6]田宏，杜军保，赵卫红，等.低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞血红素加氧酶-1 mRNA表达及细胞增殖的影响[J].基础医学与临床， 2002，22（6）：525-528.

[7]王雪冰，路瑛丽，冯连世，等.低氧训练对大鼠肾皮质 H IF-1α、VEGF基因表达的影响[J].体育科学，2009，29（2）：59-64.

[8]徐建方，张漓，冯连世.运动与NO/NOS系统和CO/HO系统的研究进展[J].中国运动医学杂志，2004，23（4）：453-457.

[9]于清霞，孙春丽，刘同涛.血红素加氧酶/一氧化碳通路与高血压[J].心血管病学进展，2005，26（1）：14-17.

[10]赵鹏，路瑛丽，冯连世，等.低氧训练对大鼠骨骼肌 H IF-1α基因表达的影响[J].山东大学学报（理学版），2009，44（5）：1-9.

[11]赵鹏，路瑛丽，冯连世，等.低氧训练对大鼠骨骼肌血红素氧合酶m RNA表达的影响[J].中国运动医学杂志，2009，28（3）： 286-288.

[12]周君琳，凌亦凌，金国华，等.内源性一氧化碳减轻大鼠双侧后肢缺血再灌注所致的肺损[J].生理学报，2002，54（3）：229-233.

[13]ARIEL H POL IZIO，SOLEDAD GONZALES，MARINA CMUÑOZ，etal.Behaviour of the anti-oxidant defence system and heme oxygenase-1 p rotein exp ression in fructose-hypertensive rats[J].Clini Experimental Pharmacol Physiol，2006，（33）： 734-739.

[14]HANS HOPPELER，M ICHAEL VOGT，EWALD RWEIBEL，etal.Response of skeletalmusclemitochondria to hypoxia[J].Exp Physiol，2003，88（1）：109-119.

[15]L ERIC HUANG，H FRAN KL IN BUNN.Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance[J].J Biol Chem，2003，278 （22）：19575-19578.

[16]M A ERARIO，S GONZALES，SROMA Y，etal.Role of heme oxygenase/carbonmonoxide pathway on the vascular portal hypertensive rats[J].Clin Experimen Pharmacol Physiol，2005， （32）：196-201.