生物检材中氯氮平的气相色谱和气相色谱/质谱检测1）

王哲焱，尉志文，王 勇，贠克明

氯氮平（Clozapine）属于苯二氮卓类药物（弱安定剂）。在体内吸收快，但排泄慢，长期服用或大量服用均可引起中毒［1，2］。药物中毒也见于药物滥用导致的意外中毒以及麻醉抢劫这类案件中，向法医毒物分析检验的鉴定工作提出了新的挑战［3］。因此本文建立生物检材中氯氮平的气相色谱和气相色谱/质谱检测方法，可应用于临床氯氮平中毒检验诊断和氯氮平中毒死亡的法医学检验。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 氯氮平标准品购于公安部，氯氮平片（上海医药有限公司信谊制药总厂，批准文字：国药准字H31021152）；0.5 mol/L NaOH 溶液；SKF525（内标液）配制成1.0 mg/mL的乙醇储备液，置冰箱保存；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器及色谱条件 气相色谱（Finnigan）条件：DB－5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱温220℃，1 min→20℃/min→280℃，6 min；检测器：300℃，空气60 kPa，氢气2.3 k Pa，载气N22.0 mL/min，NPD检测器。分流进样，进样量1μL。气相色谱－质谱联用仪（Finnigan）条件：DB－5毛细管柱（30 m×0.25 m×0.25μm），EI源70ev；质量范围：50－650，柱温220℃，1 min→20℃/min→280℃，6 min；离子源温度：250℃，传输线温度：280℃，载气：He 2.0 m L/min。

1.3 提取和检测 取固体检材1 g或血1 m L，加蒸馏水1 m L，加入内标液10μL，振荡，固性检材超声细胞粉碎（JYD－650L智能型）匀浆3 min，0.5 mol/L NaOH 调p H10，振荡摇匀，加入5 mL乙醚，振荡15 min，1800 r/min离心10 min，将上清液移入另一干净且干燥试管中，重复萃取一次。40℃恒温水浴中挥干，20μL无水乙醇定容，取1μL进样检测，保留时间定性，内标法和工作曲线法定量。气相色谱－质谱联机分析，选择离子模式检测（SIM），质谱图、质量色谱图定性，气相色谱检测，内标法定量。

1.4 动物实验 Wister大鼠6只，体重（180±10）g，河北省实验动物中心提供，实验前禁食24 h。经灌胃匀速注入LD50（351mg/kg）氯氮平，给药后观察大鼠的中毒症状，2 h立即处死，取心血、心、肝、脾、肺、肾、脑按上述方法条件提取检测其中氯氮平含量。

2 结 果

2.1 气相色谱图、质谱图（见图1～图10）

图10 内标SKF525A的标准质谱图

2.2 响应曲线和精密度 取氯氮平标准液（1 mg/m L），用乙醇将母液稀释成40.0μg/m L、30.0μg/m L、20.0μg/m L、16.0 μg/m L、8.0μg/m L、4.0μg/m L、2.0μg/m L、1.0μg/m L 的标准溶液系列。分别取1μL标准溶液，依上述气相色谱条件下进样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归，得其回归方程为Y＝8327X－2687（r＝0.987），两者之间线性关系良好，经t检验有统计学意义（P＜0.05），检出限为30 ng（S/N＞3）。

取浓度为0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.8μg/μL的三种标准溶液在上述气相色谱条件下每样品每日测定5次，连续测定3 d，其日内、日间保留时间为（7.80±0.23）min、（7.80±0.17）min。2.3 标准曲线和提取回收率 分别取空白肝组织1 g和心血1 m L，各12份，置于离心管中，各加蒸馏水1 m L和内标液10μL（1 mg/mL），振荡，按加入氯氮平标准液配制成质量浓度为0.1 μg/m L（μg/g）、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L、4μg/m L、8 μg/mL、12μg/mL、16μg/m L、18μg/mL、24μg/mL、28 μg/m L、32μg/m L的标准系列，按1.3检材提取和检测。建立的心血和肝组织中氯氮平检测的标准曲线回归方程Y＝33.396X＋0.9248（μg/m L）和 Y＝36.947X＋0.1264（μg/g），式中Y为心血或肝组织中氯氮平浓度，x为氯氮平峰面积与内标峰面积比值；相关系数分别为0.985和0.984；线性范围均为（0.1～48）μg/m L，最低检出浓度为0.1μg/m L或 μg/g（S/N＞3）。

取肝组织1 g或心血1 m L，各9份，分别加入标准品4μg（3份）、8μg（3份）、20μg（3份），按上述方法提取检测，标准曲线计算回收率。回收率和变异系数分别为（91.3±1.5）%～（105.3±1.74）%和1.82～8.72。

2.4 染毒大鼠体内氯氮平检测 染毒大鼠心血和各脏器中均检 出氯氮平。大鼠心血、心、肝、脾、肺、肾、脑的含量依次为（19.7±6.9）μg/mL、（5.6±2.3）μg/m L、（25.8±4.0）μg/mL、（34.5±4.7）μg/m L、（13.0±2.2）μg/m L、（20.0±4.3）μg/m L、（40.9±39.6）μg/mL。

3 讨 论

已报道的氯氮平检测方法有：HPLC、RP－HPLC、LC－MS/MS、固相微萃取－气相色谱质谱法、GC/MS等［4－11］。但是本文所建立的GC、GC/MS检测方法，一方面确保定性准确，另一方面又保证了定量结果的准确。

以SKF525为内标，其保留时间（TR＝3.45，氯氮平TR＝7.8）合适，峰型良好，与氯氮平分离度Rs＞2，且与生物检材中的杂质峰分离良好，在较高浓度范围内有较好的线性关系，提取回收率及精密度均达到检案要求，且重现性好，灵敏度高，可满足定性、定量检验的分析要求，可用于生物检材中氯氮平含量的定性和定量分析。

本实验氯氮平染毒大鼠体内检材用上述方法提取、净化、浓缩后检验，同样可获得稳定可靠的分析结果。结果显示，各脏器内氯氮平含量变化不大，说明生物样品组成对氯氮平的检测没有影响［12］，以心血、肝、肺含量较高，与文献［13］报道氯氮平在家兔体内分布特点结果相同。

由于气相色谱/质谱检测方法选择性好，定性准确，气相色谱检测简便，快速，灵敏，定量结果准确，因此既可用于氯氮平中毒或死亡案件的法医学鉴定和法医毒物动力学研究［14］，也可用于氯氮平中毒的临床快速检验诊断。

［1］邱泽武.氯氮平的临床不良反应［J］.医药导报，1995（1）：42－44.

［2］夏忠华.氯氮平的不良反应［J］.哈尔滨医药，2002（2）：35－38.

［3］余自成.氯氮平血药浓度快速测定方法的研究［J］.药物分析杂志，1998（6）：123－125.

［4］钱南萍，马莹，夏晓燕.HPLC法测定人血浆中氯氮平浓度［J］.江苏药学与临床研究，2006（5）：85－87.

［5］邹冬良，朱荣华.RP－HPLC法测定人血浆中氯氮平浓度［J］.湖南师范大学学报（医学版），2008（3）：215－217.

［6］王贤亲，潘晓军，林观样，等.LC－MS/MS同时测定人血浆中氯氮平、奥氮平和米氮平［J］.法医学杂志，2009（2）：157－158.

［7］钱南萍，马莹，夏晓燕.HPLC法测定人血浆中氯氮平浓度［J］.江苏药学与临床研究，2006（5）：323－325.

［8］孙祥德，齐伟，高革，等.反相高效液相色谱法测定人血清中氯氮平含量［J］.新乡医学院学报，2001（3）：87－89.

［9］吴岚，朱军，刘文宪，等.高效液相色谱法测定人血浆中氯氮平浓度［J］.医药导报，2008（4）：156－157.

［10］马武翔，范明芳.HPLC法测定人血浆中氯氮平浓度［J］.中国临床药学杂志，2004（2）：165－166.

［11］王琦玮，莫耀南，周海梅，等.固相微萃取－气相色谱质谱法测定血浆中的氯氮平浓度［J］.中国法医学杂志，2007（2）：187－189.

［12］马锦琦，周海梅，王琦玮，等.生物样品组成对氯氮平浓度检测的影响［J］.中国医院药学杂志，2007（9）：76－78.

［13］贠克明，李贵明.氯氮平在家兔体内的分布研究［J］.法医学杂志，2007，13（1）：14－15.

［14］贠克明.法医毒物动力学［J］.中国法医学杂志，2008，23（6）：361－369.