异烟肼在家兔体内的死后分布研究1）

常明亮，任 飞，贠克明，贾美娟

异烟肼（INH），又名雷米封（Rimifen），为临床抗结核药，毒性较大，不良反应严重、多样，主要中毒症状有：步态不稳或麻木针刺感、烧灼感或手脚疼痛；深色尿、眼或皮肤黄染；异常乏力或软弱、恶心或呕吐；偶有视力模糊或视力减退、发热、皮疹等。虽然毒性较强，但因尚无可取代的药物，目前仍为临床一线抗结核药［1，2］，服药过量或 自 杀 中 毒 死 亡 事 件 时 有 发 生［3－7］，需 进 行 法医学鉴定。

有关异烟肼法医毒物动力学研究报道较少，仅见生物检材内异烟肼的检测方法、个别中毒（死）案件的检验报道［9－15］，但对中毒死亡者体内的分布情况报道甚少，所以需进一步进行系统

的法医毒物动力学研究。本研究建立异烟肼口服中毒致死大鼠的动物模型，研究异烟肼在中毒致死家兔的体内分布，为异烟肼中毒（死）案件的法医学鉴定提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和药品 异烟肼标准品（公安部二所提供），SDE（水杨醛）；异烟肼标准溶液：1 mg/m L水溶液；SDE标准溶液：250 mL水中加入2.5 m L SDE，振摇，静置，4℃冰箱保存待用；其他试剂均为国产分析纯。异烟肼片剂：每片100 mg，天生制药集团有限公司生产，批号：0801002。

1.2 实验动物 实验动物为健康雄性家兔，体重（2.0±0.7）kg，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.3 仪器与分析条件

1.3.1 仪器 CS－930薄层色谱扫描仪（日本岛津）；日本岛津高效液相色谱仪，WDL－95色谱工作站。

1.3.2 分析条件 薄层色谱法条件，薄层板∶HSGF25410 cm×10 cm×0.25 mm；展开剂：三氯甲烷：甲醇（9∶1），上行展开5 cm～7 cm。光谱扫描：200 nm～370 nm，Difference扫描方式，记录吸光度，进行定性分析。液相色谱条件，色谱分离柱：YWG－C18柱（4.6 mm ×250 mm，5μm）；预柱：YWG－C18柱（6 mm×25 mm，5μm）；流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾－甲醇（65∶35）；检测波长295 nm；流速：1 m L/min；进样量20μL。

1.4 方法

1.4.1 实验动物模型 健康家兔6只，随机分为实验组（4只）和对照组（2只），隔夜禁食，实验期间补充生理盐水。家兔仰卧位固定于兔台，开口器将口打开并固定，经开口器中孔，沿咽后壁正中线向下插入导尿管（25 cm～28 cm），用注射器推入2 mL～3 m L空气，确证导尿管入胃后，经导尿管注入异烟肼0.56 mg/kg（2倍LD50），再注入水5 m L～10 m L，夹闭导尿管末端，缓缓拔出导尿管。家兔死亡后，迅速解剖动物，取心血和玻璃体液各2 m L，在血液中分别加入肝素钠溶液0.5 m L，依次取心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、胃壁脏器部分组织，放置于－20℃冰箱内保存待检。

1.4.2 组织脏器、体液中异烟肼的检测

1.4.2.1 异烟肼的定性检测 固性组织检材取2 g，加水3 m L匀浆，加饱和硫酸铵溶4 m L，80℃～90℃水浴15 min，冷却至室温，1800 r/min离心20 min，取上清液2.5 m L加等量SDE饱和水溶液，40℃水浴20 min～30 min，冷却至室温，加乙酸乙酯8 mL，振荡15 min，1800 r/min，离心10 min，分取有机层，80℃或40℃水浴，挥干。乙酸乙酯100μL定容，5μL点样，于展开剂（三氯甲烷∶甲醇为9∶1）中展开，Rf值结合光谱扫描定性。血或玻璃体液2.5 m L直接加SDE饱和水溶液2.5 m L，余同固性检材。

1.4.2.2 异烟肼的定量检测 别取血或玻璃体液样品各0.25 m L于1 m L离心试管中，加入10%三氯醋酸50μL，1.6%水杨醛溶液40μL，加甲醇至0.5 m L后于40℃水浴反应20 min，冷却，高速离心（10000 r/min）5 min。吸取全部上清液，稀释10倍后，取稀释液20μL进样，HPLC检测。外标法定量。取匀浆后的各脏器样品0.5 g于1 m L离心试管中，加入10%三氯醋酸50μL，1.6%水杨醛溶液40μL，甲醇0.5 m L，经混旋后于50℃水浴反应20 min，冷却，余同体液样品。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示。

《新三字经》里说：“人之初，如玉璞。”人的先天并无好坏之分、善恶之别，只因受家庭、学校教育和社会的影响，才有所谓好学生与落后学生，好人与坏人之分。一个班级、一个学校总在不同程度上有后进生的存在。

2 结 果

2.1 动物表现 家兔在INH灌胃后30 min左右便开始出现呼吸抑制、昏迷、全身阵发性强直性痉挛，呈癫痫大发作样抽搐，有不同程度的共济失调，于2 h±30 min死亡。

2.2 异烟肼的检测

2.2.1 异烟肼衍生化薄层色谱扫描检测 异烟肼、水杨醛、异烟肼－水杨醛腙薄层分析Rf值分别为：INH（Rf＝0.39），INH 之SDE衍生物（Rf＝0.56），SDE（Rf＝0.93）。

2.2.2 异烟肼衍生化后高效液相色谱图（见图1～图3）

2.2.3 工作曲线（见表1） 取空白血液样品各7份（每份0.25 m L）于离心试管中，分别加入浓度为0.5 mg/L的INH标准溶液0.2μL、0.8μL、2.0μL、4.0μL、8.0μL、12.0μL、15.0μL；再加入10%三氯醋酸50μL和1.6%水杨醛溶液40μL，加甲醇至0.5 mL，配制成浓度为0.2 mg/L、0.8 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、12.0 mg/L、15.0 mg/L标准异烟肼体液样品，于40℃水浴反应20 min，冷却，高速离心（10000 r/min）5 min。取上清液20μL进样。

表1 异烟肼工作曲线

2.2.4 回收率及精密度实验 分别取15份空白血液各1 m L，15份空白肝脏各1 g，均分为3组。每组分别加入异烟肼0.4 μg/m L、4μg/m L、8μg/m L，提取检测。同时取1 d内5次测定结果计算日内相对标准差，以3 d内5次测定结果计算日间相对标准差，详见表2。

表2 异烟肼回收率及精密度

2.3 染毒家兔实验结果（见表3） 胃＞肾＞血＞玻璃体液＞心＞脑＞脾＞肺＞肌＞肝，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 2倍LD50剂量染毒致死家兔体内异烟肼含量 μg/g

3 讨 论

本研究结果显示，在给药异烟肼2倍LD50剂量（560 mg/kg）150 min内6只家兔死亡，异烟肼2倍LD50剂量中毒致死家兔心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、肌肉、血、玻璃体液内的异烟肼的含量分别为（31.22±16.15）μg/g（μg/mL）、（18.50±12.61）μg/g、（25.62 ±1.37）μg/g、（20.89±5.18）μg/g、（52.98±8.60）μg/g、（131.59±15.30）μg/g、（28.20±8.50）μg/g、（20.30±7.50）μg/g、（45.4±12.2）μg/g、（40.8±16.3）μg/g，其异烟肼含量排列顺序为：胃＞肾＞血＞玻璃体液＞心＞脑＞脾＞肺＞肌肉＞肝，差异有统计学意义（P＜0.05）。异烟肼由它的中毒原因决定了胃中含量较高，肾的含量较高可能是与异烟肼为水溶性药物而且该脏器为异烟肼的主要排泄解毒器官有关，肝中含量较低可能是由大剂量药物促使家兔急死，血液中药物未完全分布到肝脏。

本实验结果与金鸣等［16，17］报道的200 mg/kg灌胃家兔体内INH的死后分布趋势（胃＞肾＞玻璃体液＞肺＞脑＞血＞心＞肝）不同。低剂量（200 mg/kg）组较其高剂量（560 mg/kg）组心、血、浓度较低，肺浓度较高。这可能是由于高剂量组家兔死亡快，血液中药物未完全分布组织脏器中，导致血中浓度高。两组数据中一致显示肾的浓度都相对较高。考虑高低剂量两组肾均系家兔主要解毒器官。因此，INH不同剂量组在家兔体内分布趋势不完全相同。提示INH中毒（死）案件法医学鉴定时，宜采取肾、玻璃体液、脑等受剂量影响小的脏器，并应考虑中毒量及中毒死亡时间，进行全面定性和定量分析。

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