不同年龄自发性高血压大鼠心脏AT2R的表达与心肌纤维化

罗素芬，黄群英，王华军，晋学庆

（福建省厦门长庚医院内分泌代谢科，厦门 361028）

肾素-血管紧张素系统（RSA）在调节血压、维持水电解质平衡以及某些心血管疾病的发生、发展中，都是极为重要的。近年来，随着研究的深入，人们发现RAS不仅存在于循环系统中，而且存在于血管、心脏、肾脏等局部组织，通过旁分泌、自分泌和细胞间分泌等形式发挥作用。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS主要活性肽，在血压调节和体液平衡中起重要作用，并且与高血压发病机理有关。AngⅡ的生物学效应是通过与其相应受体结合而实现的。AngⅡ受体主要有AT1R、AT2R两种。SHR作为原发性高血压良好的动物模型，其血压随着年龄的增长而逐渐升高，本研究观察不同月龄自发性高血压大鼠心脏AT2R的表达及心肌纤维化，初步探讨AT2R在高血压发生、发展过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SHR和WKY由本研究所动物饲养室饲养。饲料由上海必凯公司提供［SCXK（沪）2003-0003］。实验分组：一月龄组、二月龄组、三月龄组、六月龄组和九月龄组雄性SHR共5组，每组各6只，各组均有相应月龄及数量匹配的WKY大鼠作对照。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：一月龄组、二月龄组、三月龄组、六月龄组和九月龄组雄性SHR共5组，每组各6只，且各组均有相应月龄的WKY大鼠作对照。

1.2.2 血压的测量：采用RBP-I型大鼠血压心率测定仪，在大鼠清醒状态下间接测量动脉收缩压（SBP）。

1.2.3 放免法测定血浆AngⅡ水平：按说明书，大鼠断头后取血2mL，立即注入预冷的含酶抑制剂（3.0mmol/LEDTA二钠，3.4mmol/L8-羟基喹啉，3.2mmol/L二巯基丙醇）的试管中，4℃、3000rpm离心5min，取上清液，-70℃保存。测定采用125I-AngⅡ标记的放射免疫分析，SN-682B-3型放射免疫γ-计数器记录结果。结果以pg/mL表示。本试剂盒测定范围10-2000pg/mL，灵敏度为5pg/mL，批内变异系数CVw＜10％，批间变异系数CVb＜15％，与AngI交叉反应率＜0.01％，试剂盒提供的抗体与人心钠素、降钙素基因相关肽以及舒血管肠肽等均无交叉反应。

1.2.4 免疫组织化学（SP法）：甲醛固定的心脏组织经石蜡包埋，切片；常规脱蜡，水化；3％过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；以1∶3稀释胰酶修复抗原；加入一抗（1∶150AT2R），4℃过夜；滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温30min；DAB（北京中山生物技术有限公司）显色；苏木素复染；脱水，透明，中性树胶封固。结果判断：当胞浆中出现棕黄色颗粒染色时判为阳性染色并以染色阳性细胞比例评定阳性表达，利用图象分析仪（LEICAQ-500），分析测定阳性表达细胞胞浆的染色面积。对照实验：以1％PBS代替一抗为阴性对照。

1.2.5 心肌胶原

饱和苦味酸天狼星红染色法使胶原特殊染色，心肌细胞呈黄色，胶原呈红色。光学显微镜观察心肌切片心脏内膜、心脏外膜及心肌小动脉周围胶原沉积的情况。

1.3 统计分析

所得的数据用均数±标准差表示。各组间比较采用单因素方差分析，多个样本均数及两两比较用ANOVA检验。数据使用SPSS13.0统计软件处理。P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 不同月龄SHR与WKY血压的变化

SHR SBP随着月龄的增加呈持续上升（P＜0.05），而WKY无类似趋势（P＞0.05）；S6 SBP明显高于S1［（180.83±9.70mmHg）VS（132.33±5.61mmHg），P＜0.05］，而S6与S9之间无明显差异［（180.83±9.70mmHg）VS（188.00±13.19mmHg），P＞0.05］；SHR的SBP均高于相应配对的WKY组（P＜0.05）（图1）。

图1 不同年龄SHR和WKY血压。与相比配的WKY比较P＜0.05；与S1比较P＜0.05Fig.1 The SBP of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1

2.2 不同月龄SHR与WKY血浆AngⅡ浓度的变化

一个月后SHR血浆AngⅡ水平均高于S1［S2（849.13±24.84pg/mL）、S3（819.60±57.65pg/mL）、S6（897.00±76.99pg/mL）和S9（863.04±91.83pg/mL）VSS1（378.44±35.97pg/mL），P＜0.05］，而S2、S3、S6和S9之间比较无明显差别（P＞0.05）；WKY各月龄组血浆AngⅡ水平无明显差别（P＞0.05）；一个月后SHR血浆AngⅡ水平均高于相应配对的WKY组（P＜0.05）（图2）。

图2 不同年龄SHR和WKY血浆AngⅡ浓度。与相比配的WKY比较P＜0.05；与S1比较P＜0.05Fig.2 The plasma concentration of Ang Ⅱ of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1

2.3 不同月龄SHR与WKY心脏AT2R表达的比较

AT2R在心肌内外膜均有表达，但含量较少，主要分布在心肌细胞膜上，光学显微镜下胞浆染成棕黄色（封底图3）。图象分析示SHR心脏AT2R免疫染色阳性面积比随着月份的增加而降低，S6、S3及S9明显降低（P＜0.05），S6和S3比较无明显差别（P＞0.05）；WKY各月龄组无明显差别（P＞0.05）。SHR心脏AT2R免疫染色阳性面积比均低于相应配对的WKY组（P＜0.05）（图4）。

图4 不同年龄SHR和WKY心脏AT2R免疫组化的半定量分析。与相比配的WKY比较P＜0.05；与S1比较P＜0.05；与S2比较P＜0.05Fig.4 Quantification of AT2Rimmunohistochemical staining in heart of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1；P＜0.05 VS S2

2.4 不同月龄SHR与WKY天狼星红心肌胶原含量的比较

大鼠心肌切片用饱和苦味酸天狼星红染色法使胶原特殊染色后，在光学显微镜下观察，可见心肌细胞显黄色，而心肌细胞间和小动脉周围有红色的纤维状沉着，此即为心肌胶原（封底图5）。SHR天狼星红心肌胶原染色阳性面积百分比随着月龄的增加而增加，并均高于相应配对的WKY组（P＜0.05），WKY各组间无明显差别（P＞0.05）（图6）。

图6 不同年龄SHR和WKY心脏胶原含量。与相比配的WKY比较，P＜0.05；与S1比较，P＜0.05Fig.6 The content of collagen in the heart of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1

3 讨论

肾素-血管紧张素系统（RAS）的过度激活在高血压及相关疾病的发生发展过程中起着关键的作用。随着研究的深入，人们发现RAS不仅存在于循环系统中，而且存在于血管、心脏、肾脏等局部组织，通过旁分泌、自分泌和细胞间分泌等形式发挥作用，在心血管的发病因素中，局部RAS比循环RAS更为重要。同时，肾素-血管紧张素系统在高血压致心肌纤维化的发病机制中受到广泛关注。

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS的中心环节，通过与其靶细胞表面的特异性受体结合发挥作用。AngⅡ受体主要有AT1R、AT2R两种受体，都属于7次跨膜的G蛋白偶联受体，两者最主要的区别在于AT1R是能被Losartan选择性抑制的受体，而AT2R是被PD123319选择性抑制的。在成熟组织中，AT1R介导血管平滑肌细胞、心肌细胞、冠状动脉内皮细胞的生长与增殖［1］，这些作用相互影响，成为高血压的重要发病因素。而AT2R的功能目前则了解较少。通过研究AT2R，人们发现AT2R和AT1R的生物作用大部分相反。AT2R的激活在AT1R拮抗剂治疗上起着重要作用［2］，AT1R阻滞剂广泛应用于降压治疗，其降压机制是通过双重作用实现的，既阻断AT1R介导的升血压作用；同时又使更大量的AngⅡ作用于AT2R，也即增强了AT2R介导的降血压作用。因而研究AT2R的作用有助于进一步明确AT2R在高血压发病中的作用。

AT2R广泛分布于胎儿组织，成年脑、肾上腺髓质、卵巢、子宫、内皮细胞、心肌。AT2R与AngⅡ结合后，使G蛋白激活，进而激活一系列磷酸酶，其中主要激活的MKP-1是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）特异的磷酸酶，与血管重构和高血压关系密切。AngⅡ通过AT2R抑制细胞生长，促进细胞凋亡、细胞分化、血管舒张，促进一氧化氮的产生和释放。在心脏、动脉和肾脏，AngⅡ通过激活AT2R，刺激NO/cGMP释放，介导血管舒张，从而对抗AT1R介导的功能并发挥潜在的保护作用。Ichiki等［3］发现敲除AT2R基因的小鼠与对照的野生型小鼠相比血管舒张反应减弱，动脉压升高2.67～3.33KPa，且对AT1R介导的加压反应明显增强，证明AT1R调节缩血管作用，而AT2R调节扩血管作用，AT2R激活能抑制AT1R介导的升压作用。Vazquez［4］等研究发现，在5/6肾脏切除术动物模型中提前给AT1R拮抗剂氯沙坦治疗的动物AT2R表达大大增加，而AT2R拮抗剂PD-123319则减少AT2R表达、增加肾脏损伤和升高血压，表明AT2R代表着一种反调节作用机制来保护局部缺血性肾损伤。Arima等［5］研究发现：AngⅡ激活兔入球小动脉上的AT2R，引起入球小动脉舒张。剥除血管内皮或抑制细胞色素P450途径，尤其是抑制环氧二十三烯酸的合成时，可完全抑制这一血管舒张反应。AT2R总是下调由AT1R介导引起的反应，结果是细胞增殖下降、血浆AVP水平下降、对缩血管物质的反应下降［6］。此外，高血压发病过程中，对心脏的影响主要是左心室心肌肥厚，是由于心肌细胞肥大，同时心肌间质胶原纤维不成比例的增加［7］。最明显的是心肌胶原过度合成和沉积，并导致心肌纤维化［8］。高血压心肌纤维化在形态上主要表现为心肌间质中胶原的异常堆积，其特征为心肌胶原浓度增加或心肌胶原容积分数增高。Martin Paul和Daniel A等［9，10］分别研究发现，高血压心脏病患者不论其心室负荷状况如何，左右心室都存在心肌纤维化，因而提出血液动力学并不是心肌纤维化的唯一机制，体液因子、激素和代谢等因素均参与心肌纤维化。而RAS在高血压致心肌纤维化的发病机制中受到广泛关注，在心脏和血管局部完整的RAS的存在，主要参与血管紧张性与局部功能的调节。而AT2R的激活可能主要表现为在心肌组织内发挥作用，产生潜在的扩血管、抗增殖和心肌保护功能。研究表明AT2R介导心肌细胞凋亡，Li Js等［11］在培养的乳鼠心肌细胞和成纤维细胞的研究中发现，AT1R介导细胞生长，对心肌细胞具有营养效应，在心室重构中起到重要作用，而AT2R兴奋则抑制AT1R依赖性生长，AT1R阻断后可引起培养乳鼠心肌细胞凋亡。

本研究通过观察自发性高血压大鼠（SHR）其血压随着年龄的增长而逐渐升高，心脏AT2R蛋白表达随着年龄的增加而降低且低于WKY，而WKY的AT2R蛋白表达随年龄增加无类似趋势；此外，SHR心肌胶原分布明显多于同龄WKY大鼠，SHR心肌纤维化随着年龄的增加而加重。提示AT2R在高血压发生、发展过程中的作用，这将对制定高血压治疗新方案有重要意义。

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